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目的1)明确高迁移率蛋白族 B1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)对 T淋巴细胞增殖的影响。2)探究 HMGB1 对 p53(tumorprotein 53,p53)表达的影响。3)通过干扰p53表达,明确p53在介导HMGB1对T淋巴细胞增殖抑制的作用,并进一步探讨p53在HMGB1诱导的T淋巴细胞凋亡和功能紊乱中的作用。4)检测丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKs)通路活性以探索HMGB1诱导p53表达的可能机制。5)利用特异性p38抑制剂,明确p38信号通路在HMGB1诱导p53活化中的作用。方法1)根据细胞培养时间将Jurkat细胞分为0(正常组)、12、24、48h培养组,将100ng/mlHMGB1加入培养基后培养相应时间;根据细胞培养时加入HMGB1浓度将Jurkat细胞分为0(正常组)、10、100、1 000ng/ml组,加入相应浓度HMGB1连续培养24 h。采用CCK-8法检测各组Jurkat细胞增殖情况,荧光定量-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞样本中p53、p21及泛素蛋白酶小鼠双微体蛋白(murinedouble minute2,mdm2)mRNA 表达水平,Western blot 检测磷酸化 p53 及 p53、p21、mdm2的蛋白表达水平。2)将载有p53shRNA表达质粒和空白载体的慢病毒转染入Jurkat细胞中。加入嘌呤霉素对细胞进行筛选,建立稳定表达细胞株。将以上2种细胞分别分为对照组和HMGB1 组,加入 100ng/mlHMGB1 培养 24h。CCK-8 法检测细胞增殖,RT-PCR、Western blot法分别检测细胞样本中p53 mRNA、磷酸化p53和p53蛋白的表达水平;提取细胞核蛋白后检测活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)活性；留取上清采用ELISA法检测细胞因子IL-2、IL-4、IFN-y的水平;将细胞用Annxin V/7-AAD染色后,利用流式细胞仪分析凋亡细胞比率,并检测凋亡相关因子B淋巴细胞瘤-2(B-celllymphoma-2,bcl-2)、bax和激活胱天蛋白酶(caspase)-3蛋白的表达水平3)将培养的Jurkat细胞分为正常组和HMGB1组,予相应处理后,Westernblot法检测细胞中磷酸化细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)1/2、ERK1/2、磷酸化 p38、p38、磷酸化 c-Jun 氨基末端激酶(c-JunN-terminal kinase,JNK)和JNK蛋白表达水平。4)将培养的Jurkat细胞分为正常组、HMGB1组和SB203580+HMGB1组,进行相应处理后,RT-PCR、Western blot 法检测细胞 p53 mRNA、p21 mRNA、mdm2 mRNA的表达、磷酸化p53及p53蛋白的表达水平。结果1)HMGB1抑制Jurkat细胞增殖活性HMGB1(100ng/ml)刺激细胞24、48h后细胞增殖率降低(P<0.05),刺激12h后变化不大;中高浓度HMGB1(100、1000ng/ml)刺激细胞24h后,增殖率明显下降(p<0.05),HMGB1(10ng/ml)刺激细胞后无明显差异。2)HMGB1诱导p53mRNA和蛋白水平表达增加低浓度HMGB1(10 ng/ml)刺激细胞即可使p53 mRNA水平、磷酸化p53和p53蛋白水平表达增加(p<0.05),中浓度HMGB1(100ng/ml)刺激细胞24、48h后p53 mRNA水平逐渐升高、磷酸化p53及p53蛋白表达水平也相应增加(p<0.05),且增高的p53水平具有转录活性,其下游分子mdm2和p21的mRNA表达增多(p<0.05),但高浓度组(1000 ng/ml)变化趋势不明显。3)p53介导HMGB1对细胞增殖的抑制作用利用慢病毒转染构建p53 shRNA表达的Jurkat细胞和空白对照细胞。给予HMGB1刺激后,对照组细胞增殖率明显降低,而p53shRNA表达细胞增殖率下降不明显(p<0.05)。4)p53介导HMGB1诱导的细胞凋亡。HMGB1刺激后,空白对照组中凋亡细胞数明显增多,与之相较,p53 shRNA表达细胞凋亡较少(p<0.05)。同时,两组细胞表达凋亡相关因子bcl-2、bax以及caspase-3的水平存在明显差异,并且和凋亡趋势相同(p<0.05)。5)p53介导HMGB1对T细胞功能的影响。HMGB1刺激后,空白对照组细胞中的NF-AT蛋白活性明显降低,其产生的IL-2减少,并且存在Th2漂移(IFN-γ/IL-4比值降低)。而p53 shRNA表达细胞在HMGB1刺激后,以上变化均不明显(p<0.05)。6)p38参与调节HMGB1对p53的活化作用。HMGB1刺激细胞后,MAPKs三条通路中只有p38被明显活化。加用特异性p38抑制剂SB203580后,由HMGB1激活的p53 mRNA表达以及其磷酸化和总蛋白的增加受到明显抑制制,相应地其下游因子mdm2和p21mRNA的转录减少(p<0.05)。结论:1)HMGB1具有抑制Jurkat细胞增殖的作用。2)HMGB1可有效激活p53的表达和活性。3)p53介导HMGB1引起的T细胞增殖抑制作用。4)p53还可以介导HMGB1诱导的T细胞凋亡和功能障碍。5)HMGB1可能通过活化p38通路调节p53的表达及活性。