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研究目标1.研究p16/Ki-67和p16/mcm2免疫细胞化学双染在宫颈病变中的表达及其与高危HPV感染的关联,并探讨其在宫颈癌筛查中的应用价值。2.比较这两种标志物在宫颈癌筛查中应用于HPV阳性妇女分流的效果。材料与方法收集2015年至2016年在中国医学科学院肿瘤医院(CICAMS)进行的2项前瞻性研究的细胞标本,采用之江HPV试剂盒和罗氏cobas 4800 HPV试剂盒进行HPVDNA检测,所有标本完成薄层液基细胞学检查。将筛查阳性者进行阴道镜检查和病理活检。分别采用p16/Ki-67试剂盒和p16/mcm2抗体混合物对留存标本进行免疫细胞化学双染检测。利用基线数据分析p16/Ki-67、pl6/mcm2表达与高危型HPV感染的关联。以病理结果为金标准,评价这两种标志物在总人群和HPVDNA阳性人群中对宫颈癌前病变的检出能力。研究结果1.p16/Ki-67表达与高危HPV感染关系分析:pl6/Ki-67在HPV阳性人群的表达高于HPV阴性人群(X2=95.98,P<0.001),阳性率分别为37.1%(122/329)和8.9%(43/483)。根据HPV感染型别将HPV阳性者细分为HPV16/18型和非HPV16/18 型,相应的 p16/Ki-67 阳性率分别为 34.5%(26/51)和 51.0%(96/278)。同高危HPV阴性相比,p16/Ki-67在HPV16/18型别表达的风险(OR=10.7,95%CI:5.6-20.1)近 2 倍于非 HPV16/18 型别(OR=5.4,95%CI:3.6-8.1)。2.p16/mcmm2表达与高危HPV感染关系分析:同HPV阴性组相比,p16/mcm2在HPV阳性人群的表达风险增加(OR=11.5,95%CI:8.2-16.1)。p16/mcm2阳性率在HPV阴性组、其他12种HR-HPV组、HPV16/18组分别为9.8%(53/540)、53.4%(188/352)和 63.4%(59/93)。同高危 HPV 阴性相比,pl6/mcm2 在HPV16/18型别表达的风险(OR=16.0,95%CI:9.6-26.5)是其他高危型HPV(OR=10.5,95%CI:7.4-15.0)的 1.5 倍。3.p16/Ki-67对CIN2+和CIN3+的检出能力:p16/Ki-67阳性率在病理确诊的宫颈炎、CIN1、CIN2、CIN3、宫颈鳞癌中分别为 28.2%(51/181)、44.1%(15/34)、81.8%(9/11)、93.3%(14/15)、100%(2/2),经线性趋势检验,其阳性率随病理诊断级别的升高而增强(f=38.57,P<0.001);p16/Ki-67检出CIN2+和CIN3+的灵敏度分别为89.3%和94.1%,特异度分别为69.3%和66.8%;液基细胞学检查在CIN2+和CIN3+的灵敏度分别为60.7%和64.7%,特异度分别为49.3%和 49.1%。4.p16/mcm2 对 CIN2+和 CIN3+的检出能力:p16/mcm2 在宫颈炎、CIN1、CIN2、CIN3 的阳性率分别为 53.3%(106/199)、57.1%(24/42)、77.8%(14/18)、92.0%(23/25),趋势性检验显示其阳性率随病理诊断级别的升高而升高(x2=15.4,P<0.001);在总人群中,p16/mcm2检出CIN2+和CIN3+的灵敏度分别为86.1%和92.0%,特异度分别为46.1%和44.4%;在细胞学诊断为NILM人群中,p16/mcm2检出CIN2+和CIN3+的灵敏度分别为75.0%和100%,特异度分别为46.4%和46.6%;在细胞学诊断为ASC和LSIL人群中,p16/mcm2检出CIN2+和CIN3+的灵敏度分别为85.7%和87.5%,特异度分别为45.5%和44.1%,转诊率为53.8%。5.p16/Ki-67和p16/mcm2在HPV阳性人群中对CIN2+和CIN3+的检出能力:在病理正常、CIN1、CIN2、CIN3和SCC中,p16/Ki-67阳性率分别为34.4%(41/119)、46.2%(12/26)、87.5%(7/8)、92.9%(13/14)和 100%(2/2);p16/mcm2 阳性率分别为 56.3%(67/119)、65.4%(17/26)、75.0%(6/8)、92.9%(13/14)和100%(2/2)。两标志物阳性率均随病理诊断级别的升高而升高(P<0.001)。在所有HPV阳性人群中,p16/Ki-67检测CIN2+和CIN3+的灵敏度为91.7%和93.8%,特异度为63.5%和60.8%,转诊率为36.2%;p16/mcm2检测CIN2+和CINN3+的灵敏度为87.5%和93.8%,特异度为42.1%和41.2%,转诊率为58.4%。在HPV阳性且细胞学NILM人群中,p16/Ki-67检测CIN2+和CIN3+的灵敏度为90.9%和100%,特异度为71.7%和69.4%;p16/mcm2检测CIN2+和CIN3+的灵敏度为81.8%和100%,特异度为46.2%和46.0%。研究结论1.p16/Ki-67、p16/mcm2表达与高危HPV感染,尤其是HPV16/18型别具有很强的关联性,鉴于高危HPV持续感染与宫颈癌前病变的关系,p16/Ki-67和p16/mcm2检测可考虑作为宫颈癌筛查的潜在分子标志物。2.p16/Ki-67检测灵敏度高于细胞学检查,特异度与之相似,能有效识别宫颈高度病变和指导CIN的分级;p16/Ki-67双染制片重现性较好,阅片不依赖于细胞形态学,普通技术人员经短期培训即可掌握,可考虑作为液基细胞学的替代方法用于宫颈癌筛查。p16/mcm2灵敏度较高,但特异度有限,能在细胞学正常人群中分拣出宫颈癌前病变患者,同时可用作ASC和LSIL人群的分流方法并有效降低阴道镜转诊率。3.在HPV阳性妇女中,p16/Ki-67灵敏度与p16/mcm2相似,但其特异度更高,并在更大程度上降低阴道镜转诊率。因此,p16/Ki-67是一种有应用前景的HPV分流标志物,非常适用于中国医疗资源缺乏,细胞学筛查体系不健全的广大农村地区。