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1目的建立大鼠佐剂性关节炎(Adjuvant arthritis,AA)模型,以成纤维样滑膜细胞(Fibroblast like synoviocytes,FLS)为研究对象,通过栀子苷(Geniposide,GE)和牛膝总皂苷(Achyranthes bidentata saponins,ABS)单独及两者联合整体给药,观察各给药组对AA大鼠足爪肿胀、关节炎指数、全身表现评分、运动评分及关节滑膜病理形态学的改善作用,对白细胞介素(Interleukin,IL)-1β、IL-4、IL-17和转录生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)表达水平的影响,对纤维状肌动蛋白(Filamentous actin,F-actin)分布和形态的影响,以及对整合素β1(Integrinβ1,Itgβ1)介导的细胞外信号调节激酶1/2(Extracellular signal-regulated kinase,Erk1/2)/丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPK)信号通路中关键蛋白和F-actin蛋白表达水平的改变,从而判断GE和ABS配伍给药后,ABS是否增强了GE对AA大鼠的治疗作用,以及GE可能的作用机制。2方法SD大鼠后足一侧足跖皮内注射0.1 m L弗氏完全佐剂(Freund’s completed adjuvant,FCA)对动物进行造模,模型评价成功的大鼠随机分为10组,分别为:正常组、AA模型组、GE(60 mg/kg)组、ABS(30、60、120 mg/kg)剂量组、联合治疗给药三个剂量组GE+ABS(60+30,60+60,60+120 mg/kg)、阳性药盐酸青藤碱组(Sinomenine hydrochloride,SIN,90 mg/kg)。于致炎后d 17~d 24按各组给药剂量分别灌胃给药。用足趾容积测量仪测量继发侧足肿胀,并进行多发性关节炎评分、全身表现评分及运动评分;光学显微镜下观察关节滑膜组织病理形态学的变化;FLS的分离与培养(传至第3代),免疫荧光染色法观察FLS中F-actin的分布和形态;CCK-8(Cell counting kit-8)法检测FLS的增殖;酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测IL-1β、IL-4、IL-17和TGF-β1的水平;蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测Itgβ1、Ras、P-Erk1/2、Erk1/2及F-actin蛋白的表达水平。3结果3.1各给药组对AA大鼠的治疗作用造模后d 10开始,AA大鼠表现为四肢关节出现明显的肿胀,红斑,变形,行动不便等症状,关节滑膜细胞增生明显,分布不均,关节滑膜下层纤维组织增生,并伴有大量炎性细胞浸润。连续灌胃给药7 d后,ABS组(30,60,120 mg/kg)对AA大鼠炎症状态无明显改善作用,GE(60 mg/kg)、GE+ABS(30+60,60+60,60+120 mg/kg)及SIN(90 mg/kg)给药组均能不同程度的抑制AA大鼠足肿胀度、关节炎指数、全身表现评分及运动评分(P<0.01),改善滑膜组织的炎症和病理变化,且联合用药中、高剂量组(GE+ABS:60+60,60+120 mg/kg)的治疗效果较GE(60 mg/kg)单独给药组更为显著(P<0.01)。3.2各给药组对AA大鼠FLS增殖的影响与正常组相比,AA模型组的FLS增殖能力显著升高(P<0.01);与AA组相比,GE(60 mg/kg),GE+ABS(60+30,60+60,60+120 mg/kg)及SIN(90 mg/kg)各治疗组大鼠FLS增殖能力均明显下降(P<0.01),且联合用药组的改变程度呈剂量依赖性;此外,联合用药中、高组(GE+ABS:60+60,60+120 mg/kg)的对FLS增殖反应的抑制作用明显优于GE(60 mg/kg)单独给药组(P<0.01)。3.3各给药组对AA大鼠FLS中F-actin的分布和形态学的影响正常FLS细胞边缘F-actin相对富集,细胞中间只有少许的较细的F-actin纤维;与正常组相比,AA组及ABS(30,60,90 mg/kg)三个剂量给药组的FLS中F-actin纤维集中在胞质中且纤维变得又粗又厚,细胞外围相对减少。GE(60 mg/kg),GE+ABS(60+30,60+60,60+120 mg/kg)及SIN(90 mg/kg)各治疗组均可以不同程度的减少FLS胞质中的的F-actin纤维,而在胞膜的周边出现了F-actin纤维的堆积。3.4各给药组对AA大鼠FLS中IL-1β、IL-4、IL-17、TGF-β1细胞因子表达水平的影响与正常组相比,AA大鼠FLS分泌的促炎细胞因子IL-1β和IL-17水平明显升高,抗炎细胞因子IL-4和TGF-β1水平显著降低(P<0.01)。与模型组比较,ABS(30,60,120 mg/kg)给药组对这些细胞因子的表达无明显影响,GE(60 mg/kg),GE+ABS(60+30,60+60,60+120 mg/kg)及SIN(90 mg/kg)各治疗组均可以不同程度的下调IL-1β和IL-17的表达水平,上调IL-4,TGF-β1的表达水平(P<0.01),并且联合用药组的改变程度呈剂量依赖性。此外,与GE组(60 mg/kg)相比,联合给药中,高剂量组(GE+ABS:60+60,60+120 mg/kg)的作用效果更加显著(P<0.05或P<0.01)。3.5各给药组对AA大鼠FLS中Itgβ1介导的Ras-Erk1/2信号通路中关键蛋白及F-actin表达的影响Erk1/2总蛋白表达量在所有组FLS中无明显差异;与正常组相比,模型组中Itgβ1,Ras,P-Erk1/2以及F-actin的表达均有所升高(P<0.01);与AA组相比,单独给药GE(60 mg/kg),联合给药GE+ABS(60+30,60+60,60+120 mg/kg)及SIN(90 mg/kg)给药组均能不同程度的下调这些蛋白的表达水平(P<0.01);且联合用药中、高剂量组(GE+ABS:60+60,60+120 mg/kg)的上调程度明显优于GE(60 mg/kg)单独给药组(P<0.05或P<0.01)。4结论4.1 ABS单独用药(30,60,120 mg/kg)无明显的治疗AA大鼠的作用,GE和ABS联合用药中、高剂量(GE+ABS:60+60,60+120 mg/kg)对AA大鼠的足爪肿胀度、关节炎指数、全身表现评分、运动评分以及滑膜组织的炎症和病理变化的缓解作用明显优于GE单独给药(60mg/kg),说明了ABS具有引GE下行的作用,可能是通过使GE在关节滑膜中的浓度增加,从而发挥更好的治疗AA的作用。4.2 GE发挥治疗AA可能的机制是,一方面降低Itgβ1介导F-actin与细胞外基质连接,从而抑制被激活的Ras-Erk1/2信号通路且与下调促炎细胞因子IL-1β、IL-17的水平,上调抗炎细胞因子IL-4、TGF-β1的水平有关;另一方面减少F-actin的含量,使AA模型较高的血-关节囊液屏障(Blood-joint barrier,BJB)通透性降低,减少有害物质进入关节腔,从而缓解病情。