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1.研究背景：乳腺癌是当前威胁妇女生命健康最常见的恶性肿瘤。中国是乳腺癌发病率增长最快的国家之一,中国抗癌协会公布的统计数字显示,我国近年来乳癌发病率正以每年3%的速度递增,成为城市中死亡率增长最快的癌症；另外,患者的发病年龄也呈逐渐年轻化的趋势。尽管治疗上近几年有较大的进展,但是仍然有较多的患者在治疗中(后)出现转移、复发。因此需要我们继续研究乳腺癌的发病机制,寻找更多更好治疗乳腺癌的方法。大约65%的乳腺癌表达ER,其中一半的肿瘤发生、生长依赖雌激素(雌二醇,17β-estradiol,E2).E2能部分抑制肿瘤坏死因子(TNF)诱导的ER(+)MCF-7细胞凋亡,对ER(-)的MDA-MB-231细胞则无此作用。Bcl-2表达与含ER的肿瘤组织有显著相关性：85%的Bcl-2阳性肿瘤ER阳性,28%的Bcl-2阴性肿瘤ER为阴性。Bcl-2与ER表达强相关说明Bcl-2蛋白通过ER受雌激素调节,ER可能是Bcl-2的诱导剂。临床证实ER阳性的肿瘤患者接受抗雌激素药物如三苯氧胺治疗可以影响Bcl-2过度表达,提示肿瘤细胞在使用抗雌激素药物治疗后Bcl-2蛋白下调的直接结果为细胞自动走向凋亡[1]。因此,以bcl-2蛋白的治疗途径为靶点,靶向抑制bcl-2的活性或降低bcl-2的表达,可能成为乳腺癌治疗的有效途径。Bcl-2即B细胞淋巴瘤／白血病基因2(B-Cell lymphoma/leukemia 2)最早是在1984年由Tsujimoto在研究B细胞淋巴瘤高发的t(14.18)染色体易位时发现的。Bcl-2是细胞凋亡相关蛋白Bcl-2家族中的重要抗凋亡蛋白,在多种肿瘤细胞中过表达,近年来在抗肿瘤的研究领域中一直被认为是一种癌基因,抑制肿瘤细胞凋亡程序或自体吞噬机制,进而引起肿瘤的发生、发展,且认为其与肿瘤的耐药和复发有关。多数研究表明在乳腺癌细胞中Bcl-2过表达[2],过表达的Bcl-2使肿瘤细胞更易出现复发、转移或耐药。随着人们对Bcl-2家族蛋白与肿瘤关系研究的深入,针对各作用机制的抗肿瘤药物也被相继开发,基于Bcl-2的肿瘤生物治疗手段和优势肽段、有机小分子等新药已经用于某些合适的抗凋亡蛋白。有机小分子及其衍生物是Bcl-2抑制剂开发的重要方向。棉酚(gossypol)系存在于锦葵科棉属植物棉花的种子、叶、茎及根部等器官中的一种含量较高的黄色多元酚类化合物,是Bcl-2的小分子阻断剂,研究发现,棉酚的活性成分左旋棉酚主要作用于Bcl-2/Bcl-XL基因,阻止其与促凋亡基因如Bak、Bax、Bad等结合形成异源二聚体,从而诱导肿瘤细胞发生凋亡,在体内和体外实验中均表现出有效的抗肿瘤活性。但左旋棉酚分子结构两端的醛基,被认为与毒性相关,虽然作用较弱,但很大程度上限制了人体对左旋棉酚的最大耐受量,另外这种混合物进入人体内后容易与其他蛋白结合,削弱药物的治疗效果,增加毒性作用,去除两个醛基后合成的Apogossyplone (ApoG2)是棉酚的一种新型衍生物,对其进行细胞毒性测试,结果表明对肿瘤细胞生长的抑制作用较左旋棉酚更强,显示出更好的发展前景。本研究以人乳腺癌MCF-7细胞系为研究对象,探讨ApoG2在MCF-7细胞中的作用及可能机制,为乳腺癌治疗方面提供一些新的研究方向。研究目的：本实验以高表达Bcl-2的乳腺癌细胞株MCF-7为研究对象,研究Apogossypolone (ApoG2)对人乳腺癌细胞系MCF-7的体外生长抑制作用,并初步探讨其可能的作用机制,为ApoG2的进一步研究及临床应用提供实验依据,奠定理论基础。实验方法：1.采用MTT体外增殖法研究ApoG2对乳腺癌细胞系MCF-7的体外增殖抑制作用；2.采用平板克隆形成实验检测ApoG2对乳腺癌MCF-7细胞系体外克隆形成的抑制情况；3.利用Hoechst 33258荧光染色法观察细胞在ApoG2作用于乳腺癌细胞系MCF-7后引起的细胞核形态的变化；4.流式细胞仪分析ApoG2作用于乳腺癌MCF-7细胞后引起的细胞凋亡率及细胞周期的变化情况；5.透射电镜观察ApoG2作用于乳腺癌细胞系MCF-7后引起的细胞形态学变化情况；6. Western blot实验检测分析ApoG2对细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的影响。实验结果：1.通过MTT体外增殖实验检测提示ApoG2对MCF-7细胞系具有生长增殖抑制作用,并且这种作用呈时间、剂量依赖效应。10μmol/L以上的ApoG2作用24h即可显著抑制MCF-7细胞的生长；2.平板克隆实验表明,经不同浓度(5、10、20μmol/L) ApoG2作用于乳腺癌细胞MCF-7细胞2周时,与对照组相比,药物组对细胞的克隆能力呈现显著的抑制作用(P<0.05)。3.透射电镜检测可见对照组的MCF-7细胞形态良好,而20μmol/L的ApoG2处理后的MCF-7细胞出现了自体吞噬现象：细胞内出现大量空泡,细胞体积增大,但细胞膜、核膜较为完整,染色质凝聚不明显；4. Hoechst 33258荧光染色法可见MCF-7细胞与20μmol/L的ApoG2共培养72h后呈现出明显核固缩、碎裂,染色质凝集、凋亡小体形成等凋亡现象；而对照组细胞则呈现弥散均匀,淡蓝色的正常细胞核；5.流式细胞检测技术可见20μmol/L浓度的ApoG2作用于MCF-7后细胞凋亡率升高,而且细胞周期S期和G2/M期比例较对照组升高(P<0.05)；6. Western blot检测结果提示MCF-7细胞系在ApoG2 (20μmol/L)作用72h后,细胞内bcl-2的表达较对照组减少(P<0.05)；而Bax蛋白的表达较前升高(P<0.05)。结论：ApoG2能够抑制人乳腺癌细胞系MCF-7的增殖和克隆形成,阻滞其细胞周期,诱导其发生程序性细胞死亡。其机制可能抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,增加了促凋亡蛋白Bax蛋白的表达,进而诱导了Bcl-2相关的凋亡途径,引起肿瘤细胞的死亡；同时,Bcl-2表达的下降,亦减少了Bcl-2与Beclin-1蛋白的结合,间接提高了Beclin-1蛋白的表达,促进了自体吞噬机制的发生,抑制了肿瘤的发生、发展。