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《中国药典》自2010版开始,规定了石斛来源为金钗、鼓槌以及流苏石斛的新鲜或干燥茎,及上述三种石斛的“近似种”,并将铁皮石斛单独列出,足以显示铁皮石斛的重要性。对于铁皮石斛的现代研究很多,研究的原材料也分为铁皮石斛原球茎和铁皮石斛成熟的茎条,对于不同的原材料,不同的研究者所得到的多糖信息差异较大。国内研究学者对铁皮石斛多糖进行了较深入的研究,并且取得了一定的成果。其多糖主要具有增强免疫,抗肿瘤,抗氧化,降血压,抗疲劳等作用。多糖的分离纯化,药理活性以及构效关系研究越来越受到重视。目前,研究者多采用DEAE纤维素,通过纯化水对铁皮石斛粗多糖进行初步的分离,然后再采用凝胶色谱进一步纯化,获得均一的多糖片段,并且将得到的均一多糖片段进行结构表征以及生物活性的研究。但由于研究所选的研究材料(原球茎和成熟茎)以及研究方法的差异,获得的多糖信息差异也较大。铁皮石斛多糖中水溶性多糖所占比例最高,易于获取研究,因此,本研究对铁皮石斛成熟茎的水溶性多糖成分进行了分离、纯化、结构和免疫活性的研究探讨,以期为以后进一步药效机制的研究打下基础。目的:1、分离纯化出相对均一的铁皮石斛多糖片段,并对其继续理化性质研究。2、利用HPLC、GPC、IR、NMR等仪器、甲基化分析等化学方法,对分离纯化的均一铁皮石斛多糖片段进行初步结构鉴定。3、以细胞毒性、吞噬活性、NO产生量、淋巴细胞增殖四个免疫指标,对均一的铁皮石斛多糖片段进行免疫活性的研究。方法:1、采用石油醚脱脂,80%乙醇除去小分子,水提醇沉出多糖,以及sevge除蛋白,获得铁皮石斛粗多糖(DOP)。通过DEAE-52阴离子交换树脂分离纯化获得水洗脱多糖(WDOP),Sephacryl S-300凝胶树脂纯化获得均一的铁皮石斛多糖片段(WDOPA、WDOPB)。2、采用TFA-PMP水解衍生得到单糖,以HPLC分析单糖组成和比例;考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量,乌式粘度计测定粘度。3、采用凝胶检测法和冻融分析法鉴定WDOPA和WDOPB的均一性。4、采用GPC分析测得WDOPA、WDOPB的分子量;综合IR、NMR等仪器检测、甲基化分析等化学方法分析得到的数据,从而推断出WDOPA、WDOPB可能的结构。5、应用MTT法观测WDOP和WDOPA、WDOPB对RAW264.7细胞的细胞增殖的影响、对小鼠淋巴细胞增殖作用的影响,以及对RAW264.7细胞吞噬功能的影响;应用Griess试剂检测WDOP和WDOPA、WDOPB对RAW264.7细胞分泌NO含量的变化。以比较这三个铁皮石斛多糖片段之间免疫活性的强弱效果。成果:1、分离得到了两个均一的铁皮石斛多糖片段,即WDOPA、WDOPB。2、从粗多糖(DOP)、水溶性粗多糖(WDOP)到纯化的水溶性多糖片段(WDOPA)和片段(WDOPB)分离纯化过程中,各步多糖的转移率分别为18.98%,51.40%,25.4%,13.12%;得率分别为 18.98%,9.75%,2:45%,1.28%;多糖含量分别为 70.44%,85.51%,95.36%,94.74%;蛋白质含量分别为 4.15%,2.32%,0.83%,0.75%;粘度分别为 0.37,0.30,0.28,0.26 mL/mg。以上数据说明,在逐级纯化的过程中,多糖含量越来越高,蛋白含量越来越少,粘度也越来越小,多糖越来越纯。3、铁皮石斛药材、DOP、WDOP、WDOPA、WDOPB的单糖组成分别为甘露糖:葡萄糖=2.70:1,3.64:1,5.19:1,5.90:1 和 5.24:1;WDOPA 和 WDOPB 分子量分别为 3.86×105Da、3.74×105Da。结果显示 WDOPA、WDOPB 都是以→4)-β-D-Manp-(1→和→4)-β-D-Glcp-(1→为主链,T-β-D-Manp为支链组成的结构。推测WDOPA、WDOPB可能的结构如下:WDOPA的可能重复的单元结构为:WDOPB的可能重复的单元结构为:M:β-D-Mannopyrano s eG:β-D-Glucopyranose-4M1-:→4)-β-D-Mannopyranose-(1 →-4G1-:→4)-β-D-Glucopyranose-(1→4、铁皮石斛多糖片段WDOPA、WDOPB在浓度为6.25-50 μ g/mL范围时,就对细胞存活具有显著促进作用(P<0.01),而仅经过DEAE-52阴离子交换树脂分离纯化获得的水溶性多糖(WDOP)效果则弱得多,其只有在给药浓度达到50μg/mL时,才能对细胞的存活具有明显的促进作用(P<0.01);WDOPA、WDOPB在3.125-50μg/mL浓度范围时,与空白对照组相比,能明显促进RAW264.7细胞吞噬中性红(P<0.01),且具有明显的量效关系。而相对于空白组,WDOP在25-50μg/mL,才具有明显的量效关系(P<0.01);在同一个浓度时,WDOP、WDOPA、WDOPB在12-48h范围时,48h时能极显著促进小鼠RAW264.7单核巨噬细胞系分泌NO(P<0.01),且具有明显的量效关系;相对来说48h低剂量就具有一定的促进效果,且能长时间地保持药效。WDOP、WDOPA、WDOPB在6.25-100 μg/mL浓度范围时,WDOP、WDOPA、WDOPB能显著刺激正常脾淋巴细胞的增殖(P<0.01),且具有明显的量效关系。WDOP、WDOPA、WDOPB在高剂量浓度范围内均能显著性促进小鼠T淋巴细胞增殖和小鼠B淋巴细胞增殖。且随着剂量升高,促进能力加强。结论:1、所建立的分离纯化方法可行,得率较高,能获得两个纯度较高、均一性较好的水溶性多糖片段。2、对WDOPA、WDOPB进行结构表征,表明以 1,4-linked-β-D-Manp和 1.4-linked-β-D-Glc为主链,且1,4-linked-β-D-Manp的比重分别占82%和78%。3、WDOP、WDOPA和WDOPB三者均有较好的免疫活性,而且纯化均一的水溶性多糖片段(WDOPA、WDOPB)较水溶性粗多糖WDOP免疫效果更显著。结合结构解析结论,推测在增强免疫活性的过程中,1,4-linked-β-D-Manp可能起主导作用。4、为铁皮石斛多糖可以进一步在药品和保健品领域开拓提供了有力的科学依据,为后期的深一步研究提供参考。