甜菜夜蛾肽聚糖识别蛋白PGRP-LB的抗病毒作用研究

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甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)是一种世界性重要害虫,对农业生产造成巨大损失。大量化学杀虫剂的使用致使甜菜夜蛾抗药性迅速增强,对生态环境造成破坏,使甜菜夜蛾的防控越来越难。甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeMNPV)是一种寄主专一性很强的病原微生物,能够在甜菜夜蛾种群中造成病毒病流行,是一种具有广阔应用前景的生防制剂。在病原物入侵昆虫宿主时,昆虫会启动其先天免疫系统抵抗病原物的入侵,肽聚糖识别蛋白(PGRP)是一类天然免疫分子,可以调控昆虫的免疫信号通路,在抵抗病原物入侵的过程中发挥重要作用。本研究从甜菜夜蛾中首次克隆得到一个PGRP-LB基因,对其序列结构和时空表达模式进行分析,同时利用过表达和RNA干扰技术证明PGRP-LB具有抗SeMNPV的作用,为在生产上更好的利用该病毒防控甜菜夜蛾提供了潜在靶标基因。具体研究结果如下:1.通过克隆得到甜菜夜蛾PGRP-LB(SePGRP-LB)基因。序列分析结果显示,该基因全长705 bp,编码234个氨基酸,该基因具有一个15个氨基酸的信号肽和一个酰胺酶(Amidase)结构域。系统进化分析表明,SePGRP-LB和鳞翅目昆虫的PGRPP-LB聚类到同一支,与夜蛾科的斜纹夜蛾S.litura PGRP-LB(Sl PGRP-LB)和草地贪夜蛾S.frugiperda PGRP-LB(Sf PGRP-LB)的亲缘关系最近。2.SePGRP-LB在甜菜夜蛾不同发育时期的表达结果显示,SePGRP-LB在雄成虫体内的表达量最高,其次是5龄幼虫。甜菜夜蛾不同组织的转录组分析结果显示,SePGRP-LB在脂肪体中的表达量最高,其次是表皮组织。3.利用转染SePGRP-LB过表达载体方法,成功将SePGRP-LB基因在甜菜夜蛾Se-3细胞中过表达,获得Se-PGRP-LB细胞。用SeMNPV侵染Se-PGRP-LB细胞后,发现SePGRP-LB的过表达显著降低了SeMNPV对细胞的感染率。此外,q PCR结果发现PGRP-LB过表达后接种SeMNPV 72h时其芽生型病毒粒子(BV)和包埋型病毒粒子(ODV)产量分别下降了47.8%和79.4%,表明SePGRP-LB的过表达抑制了SeMNPV的增殖。4.利用RNAi技术成功干扰SePGRP-LB基因在Se-PGRP-LB细胞中的表达。随后,利用SeMNPV侵染干扰后的细胞,结果发现,SePGRP-LB基因表达下降后,SeMNPV对Se-PGRP-LB细胞的感染率显著升高。q PCR结果亦发现接种SeMNPV 72h时其BV和ODV的产量分别提高2.51、1.50倍,表明SePGRP-LB的干扰促进了SeMNPV的增殖。5.通过ds RNA注射的方法成功干扰甜菜夜蛾幼虫体内SePGRP-LB基因的表达。随后用SeMNPV饲喂干扰后的甜菜夜蛾幼虫,结果表明,SePGRP-LB的表达下降后,显著增加了SeMNPV对甜菜夜蛾的致死率,明显降低了甜菜夜蛾对SeMNPV的抗性。本研究结果初步揭示了SePGRP-LB在甜菜夜蛾中有重要的抗病毒作用,为甜菜夜蛾的绿色防控提供新靶标,促进SeMNPV杀虫剂的高效利用,具有重要的实践意义。
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