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目的:研究骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, MSCs)的体外分离、培养和扩增,在此基础上,研究2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol ,2-ME)、抗坏血酸(ascorbic acid,AA)和胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)对MSCs体外诱导分化成DA能神经元的影响,探索鼠骨髓间充干细胞分化成多巴胺神经元(dopamine neurons,DA)的诱导条件与机制,为DA神经元的直接分化提供实验研究基础。方法:MSCs从SD大鼠骨髓中用密度梯度离心法获得,用全骨髓细胞贴壁分离和胰酶消化控制相结合的方法分离、纯化和传代培养骨髓MSCs。倒置相差显微镜观察细胞形态,通过绘制细胞生长曲线观察MSCs的自我更新和增殖能力。在一定条件下,用地塞米松(dexamethason)、β-甘油磷酸钠(β-Glycerophosphate disodiu)和AA定向诱导分化MSCs成骨细胞。第三代MSCs被种植在加有1mmol/L2-ME和10%胎牛血清预诱导培养基中。24小时后吸出培养基,用冰冷磷酸盐缓冲液冲洗三次,分别加入含5mmol/L2-ME + 100μmol/LAA或5mmol/L2-ME + 10ng/mlGDNF或5mmol/L 2-ME+100μmol/LAA+10ng/mlGDNF的无血清诱导培养基,诱导5小时后,进行DA能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、多巴胺转运蛋白(dopamine transporter,DAT)和普通神经元的神经元烯醇化酶(neuron special enolase ,NSE)的免疫细胞化学检测和TH基因的RT-PCR检测。结果:(1)从SD大鼠骨髓能分离出较高纯度的MSCs,并保持细胞的活性;在体外培养条件下大鼠骨髓MSCs贴壁生长,形成成纤维细胞样的细胞。骨髓MSCs经诱导后向骨细胞分化,茜素红S染色可见钙结节阳性。(2)含2-ME+100μmol/LAA+10ng/mlGDNF的诱导组①,2-ME+100μmol/LAA的诱导组②和2-ME+10ng/mlGDNF的诱导组③的诱导体系均能诱导MSCs向TH、DAT和NSE阳性细胞分化。其中2-ME+100μmol/LAA+10ng/mlGDNF诱导组的TH、DAT和NSE阳性细胞分化率最高。各诱导组均检测到TH mRNA的表达。结论:(1)本实验采用的全骨髓细胞贴壁分离和消化控制相结合的培养方法操作简便,条件要求低,是一种可行的大鼠骨髓MSCs取材、分离纯化和扩增的方法。培养的骨髓MSCs纯度高,细胞活力强,生物学性状稳定。其具有在体外自我更新和增殖、多向分化潜能的能力。在一定条件下能被诱导分化成骨。(2) MSCs有向DA能神经元分化的能力,2-ME+100μmol/LAA+10ng/mlGDNF组的诱导MSCs分化为DA能神经元能力最强。