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神经胶质瘤是人类中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤,约占成人原发性脑肿瘤的60%,具有生长快速、侵袭性强、死亡率和致残率高的特点。虽然神经胶质瘤的手术、放疗、化疗等综合治疗已经取得了很大的进展,但仍然面临许多挑战。因此,在分子水平上阐明胶质瘤的发病机制,为胶质瘤寻找新的治疗方法具有重要意义。随着对胶质瘤基因治疗和分子靶向治疗研究的深入,LncRNA在胶质瘤发生和发展中的作用越来越受到重视。已有研究证实:LncRNA TUG1在胶质瘤组织中表达下调,其表达与患者的病理分级和预后密切相关。TUG1在体外过表达可以促进胶质瘤细胞的凋亡,提示TUG1可能是治疗胶质瘤的潜在治疗靶点。另据报道,在胶质瘤组织中LncRNA H19的过表达与患者的预后呈负相关,沉默H19可以通过调节miR-675的表达抑制胶质瘤细胞的生长。LncRNA OIP5-AS1被发现在神经系统中高表达,它可以调节中枢神经系统发育及神经元的形成。Kim等研究发现:LncRNA OIP5-AS1可以作为HuR的竞争性内源RNA用于抑制宫颈癌细胞系HeLa细胞的增殖。然而,目前尚无相关研究表明OIP5-AS1能否在胶质瘤中发挥调节作用。已有研究表明,miR-410通过作用于其靶基因在胶质瘤细胞的增殖和侵袭中发挥了重要作用。miR-410可以特异性抑制Wnt-7b表达,从而影响口腔鳞癌的增殖和侵袭。为探讨LncRNA OIP5-AS1和miR-410对胶质瘤的调节作用,我们收集胶质瘤标本,并通过qRT-PCR实验证实:在胶质瘤组织中LncRNA OIP5-AS1的表达水平明显升高,miR-410的表达水平明显降低,两者呈负相关。并通过人胶质瘤细胞系U87细胞的细胞功能学实验及体内实验发现:下调OIP5-AS1表达可诱导U87细胞在G0/G1期停滞和凋亡。沉默OIP5-AS1表达可抑制U87细胞的增殖,侵袭和迁移,并下调Wnt-7b、p-β-catenin、GSK-3β-pS9、c-Myc、Cyclin D1的表达。双荧光素酶报告基因检测证实了OIP5-AS1与miR-410以及miR-410和Wnt-7b之间的靶向关系。综上所述,沉默OIP5-AS1可上调miR-410的表达,靶向抑制Wnt-7b/β-catenin信号转导从而抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭。第一部分OIP5-AS1和miR-410在胶质瘤组织中的表达目的:对比OIP5-AS1和miR-410在胶质瘤与正常脑组织中表达的差异并探讨OIP5-AS1表达与miR-410表达的关系。方法:收集2016年10月-2017年10月在河北医科大学第二医院神经外科手术切除的胶质瘤患者标本共65例。所取标本术后均由两名以上经验丰富的我院病理医师检查证实,并根据WHO 2007年发表的中枢神经系统肿瘤病理分类进行分组。收集同期10例行去骨瓣减压术的重度颅脑外伤的患者术中为降低颅内压,部分切除脑组织标本作为对照。通过qRT-PCR方法检测两组标本中OIP5-AS1和miR-410的表达情况并进行比较。通过Starbase 2.0预测:OIP5-AS1与miR-410的关系。采用SPSS20.0进行统计学分析。结果:1.患者临床信息及资料归纳肿瘤组65例:其中男性40人,女性25人,患者的平均年龄为46.23±12.58年。低级别胶质瘤(I/II级)29例,其中I级12例,II级17例,高级别胶质瘤(III/IV级)36例,其中III级19例,IV级17例。对照组:重度颅脑外伤患者10例。2.与正常组织相比,胶质瘤组织中OIP5-AS1的表达水平明显升高,miR-410的表达明显降低。3.OIP5-AS1在高级别胶质瘤组的表达显著高于低级别组,miR-410在高级别胶质瘤组的表达显著低于低级别组。相关性分析结果示,OIP5-AS1表达与miR-410表达呈负相关。经Starbase 2.0预测:OIP5-AS1是调节miR-410的分子海绵。小结:1.胶质瘤组织中OIP5-AS1的表达水平明显升高,miR-410的表达明显降低,提示两者可能影响胶质瘤的发生。2.OIP5-AS1和miR-410的表达与胶质瘤的病理分级相关,而且OIP5-AS1表达与miR-410表达呈负相关。提示两者可能存在靶向调节关系。第二部分OIP5-AS1和miR-410对胶质瘤细胞的增殖、侵袭、迁移及凋亡等生物学行为的影响目的:通过建立OIP5-AS1 siRNA和miR-410抑制剂转染的U87细胞系,探讨OIP5-AS1 siRNA和miR-410抑制剂对胶质瘤细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡等生物学行为的影响。方法:通过Lipofectamine-2000转染人胶质细胞瘤细胞系U87细胞。将细胞分为5组:对照组(未转染细胞)、NC组(转染NC序列的细胞)、OIP5-AS1 siRNA组(转染OIP5-AS1 siRNA的细胞)、miR-410抑制剂组(转染miR-410抑制剂的细胞)、OIP5-AS1 siRNA+miR-410抑制剂(siRNA+inhibitor)组(转染OIP5-AS1 siRNA和miR-410抑制剂的细胞)。通过MTT法检测各组U87细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞周期变化,Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞侵袭力,Wound-healing实验检测细胞迁移。结果:1.OIP5-AS1 siRNA组细胞增殖较对照组明显受到抑制。miR-410抑制剂组细胞增殖较对照组明显增强。与OIP5-AS1 siRNA组相比,siRNA+inhibitor组增殖显著增加。2.OIP5-AS1 siRNA可抑制胶质瘤细胞有丝分裂并促进其细胞凋亡,而miR-410抑制剂组的作用相反。与对照组相比,OIP5-AS1 siRNA组G0/G1期的细胞比例显著增高,而S期的细胞比例降低,细胞凋亡率明显升高;在miR-410抑制剂组G0/G1期的细胞比例降低,S期的细胞比例显著升高,细胞凋亡率明显降低。与OIP5-AS1 siRNA组相比,siRNA+inhibitor组G0/G1期细胞明显减少,S期细胞比例增加,凋亡率降低。各组G2期所占比例无显著差异。表明OIP5-AS1 siRNA可抑制胶质瘤细胞的有丝分裂并促进细胞凋亡,miR-410抑制剂组可促进胶质瘤细胞的有丝分裂并抑制凋亡。3.OIP5-AS1 siRNA能抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移,miR-410抑制剂组可促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移。OIP5-AS1 siRNA组的侵袭细胞数量和划痕修复能力显著降低,而miR-410抑制剂组的侵袭细胞数量和划痕修复能力显著升高。siRNA+inhibitor组在这两个指标上均高于OIP5-AS1 siRNA组。小结:1.沉默OIP5-AS1可抑制U87细胞的增殖、侵袭和迁移。2.下调OIP5-AS1表达可诱导U87细胞在G0/G1期停滞和凋亡。3.miR-410抑制剂可逆转OIP5-AS1 siRNA对U87细胞的生物学作用。第三部分OIP5-AS1调节miR-410靶向调控Wnt-7b/β-catenin的作用机制目的:探讨OIP5-AS1调节miR-410表达并靶向调控Wnt-7b/β-catenin的机制,明确OIP5-AS1与miR-410、miR-410与Wnt-7b之间的靶向关系。方法:实验分组同第二部分,通过Western blot实验来确定U87细胞Wnt-7b/β-catenin通路相关蛋白的表达。通过双荧光素酶报告基因检测miR-410、OIP5-AS1和Wnt-7b的靶向关系。结果:1.检测U87细胞的蛋白表达水平与对照组相比,OIP5-AS1 siRNA组Wnt-7b、p-β-catenin、GSK-3β-pS9、c-Myc和cyclin D1的蛋白表达水平降低,但在miR-410抑制剂组都是明显升高的;NC组每种蛋白的表达水平没有区别,各组总GSK-3β和总β-catenin的表达水平没有显著不同。与OIP5-AS1 siRNA组相比,siRNA+inhibitors组miR-410的表达非常低、Wnt-7b/β-catenin通路相关蛋白表达显著升高。2.OIP5-AS1与miR-410、miR-410与Wnt-7b之间存在靶向关系通过Target Scan预测软件,确定了Wnt-7b和miR-410之间的结合位点。根据双荧光素酶活性测定:与NC组相比,miR-410 mimics对OIP5-AS1-mt和Wnt-7b-mt荧光素酶活性的影响无显著差异;miR-410mimics显著下调OIP5-AS1-wt和Wnt-7b-wt的荧光素酶活性。实验结果证实:OIP5-AS1与miR-410、miR-410与Wnt-7b之间存在靶向关系。小结:1.沉默OIP5-AS1可抑制U87细胞的增殖和侵袭,并抑制Wnt-7b、p-β-catenin、GSK-3β-pS9、c-Myc和cyclin D1的表达。2.抑制miR-410可使Wnt-7b表达上调并激活Wnt信号通路及相关蛋白的表达。3.OIP5-AS1和miR-410、miR-410和Wnt-7b之间存在靶向关系。第四部分OIP5-AS1和miR-410对胶质瘤细胞体内致瘤性的影响目的:观察OIP5-AS1和miR-410对裸鼠体内胶质瘤细胞致瘤性的影响。方法:将32只雄性BALB/c裸鼠随机分为4组,每组8只。小鼠皮下注射细胞悬浮液(大约5×10~7/ml):对照组,NC组,OIP5-AS1 siRNA组、miR-410抑制剂组。肿瘤形成后,用游标卡尺测量肿瘤体的长度(a)和宽度(b),根据公式V=(ab~2)/2计算肿瘤体积。绘制肿瘤生长曲线。接种3周后,颈椎脱位处死小鼠。取出肿瘤组织,测量肿瘤重量。然后用苏木精和伊红(HE)对小鼠肿瘤组织进行染色。结果:与对照组相比:NC组裸鼠各时间点的肿瘤体积和重量无显著差异;OIP5-AS1 siRNA组裸鼠肿瘤生长受到抑制,肿瘤体积和重量明显变小;miR-410抑制剂组肿瘤体积和重量明显增大。HE染色示:对照组和NC组肿瘤具有典型的胶质瘤组织学特征,细胞密度高,浸润性生长;miR-410抑制剂组尤为明显;OIP5-AS1 siRNA组出现坏死灶、组织排列不规则、胶质瘤细胞密度明显降低。小结:沉默OIP5-AS1可抑制裸鼠胶质瘤生长,抑制miR-410表达可促进裸鼠胶质瘤生长。结论:1.在胶质瘤组织中LncRNA OIP5-AS1的表达水平明显升高,miR-410的表达明显降低。2.沉默OIP5-AS1可抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移,促进其凋亡;抑制miR-410可逆转OIP5-AS1 siRNA的作用。3.OIP5-AS1和miR-410以及miR-410和Wnt-7b之间存在靶向关系。沉默OIP5-AS1可上调miR-410表达,并靶向抑制Wnt-7b/β-catenin通路;抑制miR-410可使Wnt-7b表达上调,并激活Wnt信号通路相关蛋白的表达。4.在裸鼠体内,沉默OIP5-AS1可抑制胶质瘤生长,抑制miR-410表达可促进胶质瘤生长。