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【目的】当前我国急性ST段抬高型心肌梗死(ST-elevated Myocardial Infarction,STEMI)的发病率逐年增高,虽然心肌再灌注治疗已成为广泛开展的治疗措施,但临床疗效仍受多种因素干扰。在基础研究方面,心肌缺血再灌注损伤(Ischemia/Reperfusion Injury,I/R injury)极大地影响了再灌注治疗的疗效,目前尚无满意的预防和干预措施,因此也未形成规范治疗方案。本研究的目的是通过基础研究,探索可行的STEMI再灌注治疗后I/R损伤的防治方法。通过尝试应用全反式视黄酸(All-Trans Retinoic Acid,ATRA)防治心肌梗死再灌注后I/R损伤,阐明ATRA在心肌I/R中的作用机制及其对糖基化终末产物受体(Receptor for Advanced Glycation Endproducts,RAGE)效应机制的关系。具体建立心肌细胞和活体动物心肌梗死后I/R损伤模型,检测ATRA是否能够有效抑制心肌I/R损伤,探索能够有效消除RAGE介导的心肌I/R损伤及其他可能的机制,并总结和探索可行的I/R损伤防治策略,为有效预防和干预心肌I/R提供理论依据和干预方法。【方法】(1)建立H9C2心肌细胞缺氧再氧模拟的I/R损伤模型,比较不同浓度(10nM-100uM)的ATRA干预下,心肌细胞存活率,确定ATRA的有效浓度和毒性浓度;膜联蛋白V凋亡检测结合流式细胞学检测方法检测不同浓度ATRA的抗心肌细胞凋亡作用;用TUNEL染色方法检测ATRA抗凋亡作用;用Western-blots方法检测心肌梗死再灌注后凋亡相关信号天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)、B淋巴细胞瘤蛋白-2(B-cell lymphoma-2,BCL-2)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)表达差异;(2)在H9C2细胞缺氧再氧模拟的I/R损伤平台上,用Western-blots方法检测不同浓度ATRA干预下去整合素样金属蛋白酶10(A disintegrin and metalloproteinase10,ADAM10)和RAGE表达差异;应用ADAM10-短发夹核糖核酸(short hairpin ribonucleic acid,shRNA)干扰,重复上述实验,用Western-blots方法检测Capase-3、BCL-2、p38MAPK、JNK、ERK表达差异;用Carboxy-H2DCFDA试剂检测不同浓度ATRA干预下细胞内氧化应激程度;(3)建立小鼠左前降支(left anterior descending artery,LAD)结扎及再通模型模拟在体I/R损伤,用TTC染色方法检测ATRA干预下野生型小鼠和RAGE基因敲除小鼠心肌梗死范围差异;用超声学方法检测ATRA干预下小鼠I/R损伤后左室功能相关指标;用TUNEL染色方法检测ATRA干预下小鼠I/R损伤后心肌细胞凋亡的差异;用Western-blots方法检测ATRA干预下小鼠I/R损伤后Capase-3、BCL-2、p38MAPK、JNK、ERK表达差异;用免疫组织化学染色方法测定ATRA干预小鼠I/R损伤后,组织切片中的凋亡信号p38MAPK、JNK、ERK,以及ADAM10和RAGE表达差异。【结果】(1)H9c2细胞经I/R损伤后,相比二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)对照组,用1nM至10μM的ATRA预处理组存活细胞数量显著升高(p<0.01),但100μM浓度ATRA预处理组则表现为存活细胞数量大幅度降低(p<0.01);应用ATRA浓度范围10nM到10μM预处理组各组的膜联蛋白阳性,即凋亡细胞比例显著减少(p<0.01),且表现为浓度依赖性;TUNEL染色结果显示ATRA终浓度为10nM到10μM预处理组中,TUNEL阳性细胞数,即凋亡细胞数量显著下降(p<0.01),且表现为浓度依赖性;用Western blot方法检测ATRA终浓度为1nM到10μM细胞凋亡的直接介导因子活化的caspase-3水平显著下降,保护因子BCL-2水平显著升高,凋亡信号p38MAPK、JNK、ERK表达水平显著下降(all p<0.01),上述效应也表现为浓度依赖性。(2)H9c2细胞经I/R损伤后,ATRA浓度在10nM-10μM范围内,ADAM10表达水平较DMSO对照组显著升高,而RAGE表达水平则显著降低(p<0.01),且分别表现出正相关性和负相关性;ADAM10-shRNA可有效沉默ADAM10表达(p<0.01),且RAGE表达显著上调(p<0.01),同时应用用ATRA1μM未能显著恢复ADAM10表达,也未能显著降低由于ADAM10效应沉默后引起的RAGE高表达(p>0.05);ADAM10-shRNA沉默ADAM10表达后,Caspase-3表达显著升高(p<0.01),而BCL-2表达显著降低(p<0.01);同时用ATRA1μM和ADAM10-shRNA时,Caspase-3表达较单纯应用ADAM10-shRNA显著降低(p<0.01),BCL2表达显著升高(p<0.01),但Caspase-3表达较单纯应用ATRA1μM显著升高(p<0.01),BCL2表达较单纯应用ATRA1μM显著降低(p<0.01);用ADAM10-shRNA沉默ADAM10效应后,凋亡信号p38MAPK、JNK、ERK磷酸化激活表达均显著升高(all p<0.01);同时用ATRA 1μM和ADAM10-shRNA处理后,凋亡信号p38MAPK、JNK、ERK磷酸化激活水平分别较单纯应用ADAM10-shRNA显著降低(p<0.01),但较单纯应用ATRA 1μM显著升高(p<0.01);经ATRA浓度在10nM-10μM范围内预处理后,用Carboxy-H2DCFDA反应液检测细胞内ROS含量显著降低(p<0.01),且表现为浓度依赖性。(3)TTC染色结果显示在野生型小鼠中应用ATRA预处理显著降低了心肌I/R损伤后梗死面积(p<0.05),在糖基化终末产物基因敲除小鼠中,无论是否应用ATRA预处理,心肌I/R损伤后梗死面积与野生型对照组相比都显著降低(p<0.05);超声学检测结果显示经过ATRA预处理并进行I/R损伤造模后,小鼠心输出量、左室舒张末期容积、射血分数较未进行I/R损伤造模组显著降低(p<0.05),但心输出量和射血分数仍显著高于未经ATRA预处理组(p<0.05);心肌组织切片TUNEL染色结果显示应用ATRA预处理较直接I/R损伤造模小鼠心肌细胞凋亡数量显著减少(p<0.05);应用ATRA预处理后并后进行I/R损伤造模后,左室心肌组织细胞内凋亡保护信号BCL-2表达水平显著升高(p<0.05),而凋亡直接信号Caspase-3表达水平显著降低(p<0.05),凋亡信号p38MAPK、JNK、ERK的磷酸化激活水平显著降低(p<0.05);免疫组织化学染色结果显示应用ATRA预处理后,梗死区域心肌凋亡信号p38MAPK、JNK、ERK磷酸化激活水平显著降低(p<0.05);而ADAM10表达水平显著升高(p<0.05),RAGE表达水平显著降低(p<0.05)。【结论】本研究证实ATRA可有效防治STEMI再灌注治疗后心肌I/R损伤。(1)ATRA能够有效预防心肌梗死再灌注后的I/R损伤,减少心肌细胞凋亡和梗死面积;(2)ATRA的抑制心肌I/R损伤效应主要与通过上调ADAM 10表达水平,进而增加RAGE切割,抑制RAGE介导的心肌细胞凋亡有关;(3)ATRA还能够下调氧化应激,降低活性氧簇(Reactive Oxygen Species,ROS)水平,与抑制心肌I/R损伤相关。