目的抗菌肽是天然免疫的重要介质，具有广泛的抗菌活性，是机体防御感染的重要因素。防御素是最早发现的抗菌肽之一，分为四个类型：即α-防御素、β-防御素、植物防御素和昆虫防御素。其中，β-防御素(BD)在组织中的表达具有特异性，在局部黏膜免疫中起重要作用。β-防御素-2(BD2)是防御素家族重要成员，在天然免疫和获得性免疫中均发挥重要作用，被认为是联系先天免疫和获得性免疫的桥梁。近年来，防御素抗肿瘤活性日益受到科研工作者的关注。很多研究表明防御素在多种恶性肿瘤如多发性骨髓瘤、胃癌、鼻咽癌等的治疗中发挥着重要的作用。宫颈癌是女性高发肿瘤，占女性恶性肿瘤死亡原因第二位。尤其在发展中国家以及少数发达国家，宫颈癌发病率居高不下。本研究通过研究小鼠β-防御素-2(mBD2)在体内外的抗肿瘤作用及其机制，以期为宫颈癌的预防及生物治疗提供新的思路。方法(1)通过向小鼠腹腔注射LPS，诱导BALB／c小鼠建立急性时相反应。提取急性时相反应小鼠肺组织RNA，采用RT-PCR扩增mBD2基因全长序列，并构建pcDNA3.1(+)／mBD2真核表达质粒。(2)将pcDNA3.1(+)／mBD2、pcDNA3.1(+)／rmBD2质粒转染宫颈癌细胞株SiHa，同时设立转染pcDNA3.1(+)的空质粒对照。采用G418对转染细胞进行稳定表达株的筛选，并对筛选得到的细胞株采用RT-PCR、Western Blot、免疫荧光染色等方法进行鉴定。采用细胞活力分析仪及TUNEL、Annexin V等方法测定细胞活力和细胞凋亡，并计算细胞凋亡指数。(3)采用稳定转染细胞株建立裸鼠移植瘤模型，观察肿瘤生长情况并测量其直径，绘制肿瘤生长曲线。采用HE、免疫组织化学方法观察肿瘤组织病理改变和mBD2在肿瘤组织中的表达情况，并用TUNEL法检测肿瘤组织的凋亡情况。(4)为探讨mBD2对小鼠机体免疫功能的影响，建立BALB／c小鼠U14宫颈癌移植瘤模型，观察肿瘤生长情况。采用无内毒素质粒大抽试剂盒抽提pcDNA3.1(+)／mBD2、pcDNA3.1(+)／rmBD2和pcDNA3.1(+)质粒DNA。将荷瘤小鼠随机分为5组，分别采用抽提后去内毒素pcDNA3.1(+)／mBD2、pcDNA3.1(+)／rmBD2质粒治疗，同时设立pcDNA3.1(+)、Pt和PBS组对照；观察肿瘤生长状况、荷瘤小鼠存活时间，绘制小鼠生存曲线，采用HE、免疫组织化学方法观察瘤组织病理改变和mBD2在肿瘤组织中的表达情况，并采用PE-TEXAS Rad、PE-Cy7标记的抗小鼠CD4~+、CD8~+单克隆抗体检测各组小鼠外周血CD4~+T、CD8~+T含量及比值。同时采用瑞氏染色观察小鼠外周血血象变化。结果(1)成功提取小鼠肺组织RNA，采用RT-PCR扩增得到了大约250 bp左右的目的条带。构建得到的pcDNA3.1(+)／mBD2质粒经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切得到大约250 bp的目标小片段，而分别用EcoRⅠ和XhoⅠ单酶切只得到了大约5.3×10~3bp左右的单一目标大片段。质粒经测序分析，表明插入的mBD2基因序列正确，无突变，阅读框架也未发生改变，可以用于后续试验。(2)真核表达质粒pcDNA3.1(+)／mBD2、pcDNA3.1(+)／rmBD2及pcDNA3.1(+)质粒转染SiHa细胞后，经500μL／mL G418浓度筛选30天，分别得到稳定转染细胞株SiHa／M、SiHa／R、SiHa／K。SiHa／M、SiHa／R细胞经RT-PCR鉴定均有250 bp、220 bp左右目的条带扩增及200 bp左右的β-actin条带，而SiHa／K细胞经RT-PCR扩增只有200 bp左右的β-actin条带。Western Blot结果显示SiHa／M、SiHa／R组在大约4～6KD区域出现目标条带。免疫荧光染色结果显示，SiHa／M、SiHa／R组在胞内有荧光存在，对照组SiHa／K和SiHa未见荧光。细胞活力分析结果结果表明，SiHa／M、SiHa／R组细胞在贴壁后2～3天细胞活性明显低于SiHa／K组及未转染的SiHa细胞(P＜0.05)；但随着时间推移，细胞活性开始下降，四组细胞细胞活力无统计学意义(P＞0.05)。采用Annexin V检测方法观察细胞凋亡，SiHa／M、SiHa／R及SiHa组Annexin V~+／PI~+双阳性细胞的百分率分别为2.4％、2.3％、2.3％；Annexin V~+／PI~-细胞分别为0.9％、1.2％、1.5％；三组之间无统计学意义，P＞0.05。TUNEL染色结果可见SiHa／M、SiHa／R两组细胞凋亡发生指数较高，分别达到40.7％、30.2％，而SiHa对照组细胞凋亡率只有7.3％，实验组与SiHa对照组之间的意义有统计学意义，P＜0.05；而且SiHa／M与SiHa／R组之间的差别也具有统计学意义，P＜0.05。(3)成功建立了裸鼠宫颈癌移植瘤模型。肿瘤生长曲线显示：SiHa／K组与SiHa组肿瘤生长迅速，两组相同时间点肿瘤直径差别无统计学意义，P＞0.05；SiHa／M与SiHa／R组肿瘤生长较缓慢，与SiHa组、SiHa／K相同时间点肿瘤直径组比较，差别均有统计学意义，P＜0.05。SiHa／M与SiHa／R组相同时间点肿瘤直径相比较，P＜0.05有统计学意义。肿瘤组织HE染色结果显示，SiHa／M与SiHa／R细胞生长不活跃，局部有出血坏死，病理性核分裂相少；SiHa／K组与SiHa组肿瘤细胞生长活跃，病理性核分裂相多见，瘤细胞侵犯周围脂肪及肌肉组织。免疫组织化学染色结果显示SiHa／M与SiHa／R组有mBD2表达；由TUNEL染色结果可以看出，SiHa／M与SiHa／R组细胞凋亡较多，而SiHa／K及SiHa组细胞凋亡少，两者之间的意义有统计学意义，P＜0.05。(4)成功建立了BALB／c小鼠U14移植瘤模型。采用无内毒素质粒pcDNA3.1(+)／mBD2、pcDNA3.1(+)／rmBD2、pcDNA3.1(+)治疗造模成功的荷瘤小鼠，治疗结果显示：pcDNA组及PBS组肿瘤呈弥漫型侵袭性生长，肿瘤生长迅速，出现大范围出血、坏死，侵犯周围组织，在治疗后陆续出现死亡，并至第7天全部死亡；mBD2组与rmBD2组小鼠肿瘤生长相对缓慢，出现局部出血坏死等现象，至治疗2周，才开始出现死亡，至治疗结束时，每组仍有3只小鼠存活，而Pt组小鼠肿瘤生长慢，小鼠生长较为活跃，至治疗21天，开始出现死亡，pcDNA和PBS组与mBD2组和rmBD2组及Pt组与mBD2组和rmBD2组生存时间比较，结果有统计学意义，P＜0.05，mBD2组和rmBD2生存时间比较，也具有统计学意义。存活小鼠生长状态良好，较活跃。mBD2组与rmBD2组肿瘤组织有mBD2蛋白表达，其余三组未见有阳性信号出现。mBD2组和rmBD2组外周血中T细胞总数明显减少，但CD4~+／CD8~+比值大于2，可能与mBD2治疗作用有关。此外，外周血瑞氏染色结果显示中性粒细胞明显增加，可能与肿瘤病程后期类白细胞反应有关。结论(1)采用RT-PCR方法成功扩增了mBD2基因全长序列，并将该基因序列插入pcDNA3.1(+)，成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)／mBD2。(2)利用稳定转染细胞株成功建立裸鼠宫颈癌移植瘤模型。并采用小鼠宫颈癌细胞U14建立了BALB／c小鼠宫颈癌移植瘤模型。(3)通过培养的细胞学实验证实，mBD2能够抑制SiHa的生长和诱导细胞凋亡。通过实验动物的体内实验，证实mBD2能够抑制移植瘤的生长，延长荷瘤小鼠的生存时间，也可诱导移植瘤细胞凋亡。在抑瘤效果上，mBD2优于外加信号肽重组mBD2作用。