肺癌作为恶性肿瘤之一,也是肿瘤相关死亡的首位死因,严重影响了人类健康和生活质量,且目前仍缺乏有效预防和治疗手段。而吸烟则是人类肺癌发生发展的首要危险因素,已有许多流行病学研究证实吸烟者的肺癌患病率显著高于非吸烟者的肺癌患病率。尽管香烟烟雾能够增加肺部疾病的患病风险,但其诱导细胞恶性转化引起肺癌发生发展的具体分子机制复杂且不易阐明。最近有大量研究表明许多疾病的发生发展不仅与编码蛋白的RNA有关,同时也与ncRNA的表达失调有关。ncRNA中包括了最广为人知的微小RNA(miRNA)以及最近被广泛研究的长链非编码RNA(lncRNA)和环状RNA(circRNA)等。其中lncRNA是一类新兴且目前研究较热的大分子ncRNA,其长度超过200 nt,同时也可作为环境暴露的新的标志物,很有可能在驱动暴露疾病关联中发挥重要作用。有研究表明lncRNA通过与miRNA相互作用参与了肿瘤发生发展,但关于lncRNA与miRNA相互作用在环境有害因素,特别是吸烟所致疾病的发病机制中的作用研究较少。目的探讨长链非编码RNACCAT1(CCAT1)通过miR-218和let-7c在香烟烟雾抽提物(CSE)慢性处理所致HBE细胞恶性转化过程中的作用,从而揭示CSE所致HBE细胞恶性转化的部分分子机制,为寻找吸烟所致肺损伤和肺癌的早期生物标志提供科学线索。方法一、香烟烟雾抽提物对HBE细胞lncRNA与miRNA水平的影响用20μg/mLCSE急性处理HBE细胞0、6、12或24h,或慢性处理HBE细胞0、20、30或40代后,用RT-PCR实验方法检测细胞CCAT1、MALAT1、HOTAIR和H19的水平;用qRT-PCR实验方法检测细胞CCAT1、miR-21、miR-125a、miR-218和let-7c的水平。以观察CSE对HBE细胞lncRNA与miRNA水平的影响。二、香烟烟雾抽提物对HBE细胞BMI1水平的影响分别用0或20μg/mLCSE急性处理HBE细胞0、6、12或24h后,或慢性处理HBE细胞0、20、30或40代后,Western blot检测细胞BMI1水平。以观察CSE对HBE细胞BMI1水平的影响。三、CCAT1调控miR-218水平对香烟烟雾抽提物所致HBE细胞BMI1水平升高的影响分别将 pGL3-CCAT1-WT/pGL3-Ctrl 与 miR-218 mimic/Con mimic 共转染处理HBE细胞后,或用用100 ppm CCAT1 siRNA或Con siRNA预转染处理HBE细胞后,或用50 nM miR-218 mimic或Con mimic转染预处理HBE细胞24 h后,再使用0或20 μμg/mL CSE处理HBE细胞24 h,用荧光素酶报告基因实验方法检测荧光素酶反应强度;qRT-PCR检测细胞CCAT1水平和miR-218的水平;Western blot 检测 HBE 细胞 BMI1 的水平。分别用 100 ppm CCAT1 siRNA/Con siRNA 与 miR-218 inhibitor/Con inhibitor 共转染处理 HBE 细胞 24 h 后,再分别用0或20 μg/mL CSE处理HBE细胞24 h,利用Western blot检测HBE细胞BMI1水平。以观察CCAT1调控miR-218 水平对CSE所致HBE细胞BMI1 水平的影响。四、CCAT1通过miR-218调控BMI1在香烟烟雾抽提物所致HBE细胞恶性转化中的作用分别用 100 ppm CCAT1 siRNA/Con siRNA 与 miR-218 inhibitor/Con inhibitor共转染处理由CSE慢性处理所致恶性转化HBE细胞(T-HBE),或分别用50nM BMI1 siRNA 或 Con siRNA 转染处理 T-HBE 细胞,qRT-PCR 检测细胞 miR-218的水平,Western blot检测细胞BMI1水平,软琼脂集落形成实验观察细胞恶性程度,Transwell实验观察细胞侵袭迁移能力。以观察CCAT1通过miR-218调控BMI1对CSE所致HBE细胞恶性转化的影响。五、香烟烟雾抽提物对HBE细胞c-Myc水平的影响分别用0或20 μＬg/mL CSE急性处理HBE细胞0、6、12和24 h,或慢性处理HBE细胞0、20、30和40代后,Western blot检测细胞c-Myc水平。以观察CSE对HBE细胞c-Myc水平的影响。六、c-Myc在香烟烟雾抽提物所致HBE细胞CCAT1水平升高中的作用分别用50 nM c-Myc siRNA或Con siRNA转染HBE细胞后,分别用0或20μg/mL CSE处理HBE细胞24 h,或分别用0或20 μＬg/mL CSE急性处理HBE细胞24 h后,Western blot检测细胞c-Myc水平,qRT-PCR检测细胞CCAT1 水平;ChIP实验方法检测HBE细胞c-Myc与CCAT1启动子区结合情况。以观察c-Myc在CSE所致HBE细胞CCAT1水平升高中的作用。七、let-7c在香烟烟雾抽提物所致HBE细胞c-Myc水平升高中的作用将pmirGLO-c-Myc-3’UTR-WT/pmirGLO-Ctr1 与 let-7c mimic/Con mimic 共转染处理HBE细胞后,或用50 nM let-7c mimic或Con mimic转染预处理HBE细胞24h后,再使用0或20μμg/mLCSE处理HBE细胞24h,用荧光素酶报告基因实验方法检测细胞荧光素酶反应强度,qRT-PCR检测细胞let-7c水平,Western blot检测细胞c-Myc水平。以观察let-7c在CSE所致HBE细胞c-Myc水平升高中的作用。八、CCAT1在香烟烟雾抽提物所致HBE细胞c-Myc水平升高中的作用用100 ppm CCAT1 siRNA或Con siRNA预转染处理HBE细胞后,或分别将pGL3-CCAT1-WT/pGL3-Ctr1 与 let-7c mimic/Con mimic 共转染处理 HBE 细胞后,再联合0或20μg/mL CSE处理HBE细胞24 h;分别用100ppm CCAT1 siRNA/Con siRNA 与 let-7c inhibitor/Con inhibitor 共转染处理 HBE 细胞 24 h 后,再分别用 0 或 20 μg/mL CSE 处理 HBE 细胞 24 h,qRT-PCR 检测细胞 CCAT1 和 let-7c水平,Western blot检测HBE细胞c-Myc水平;荧光素酶报告基因实验方法检测荧光素酶反应强度。以观察CCAT1在香烟烟雾抽提物所致HBE细胞c-Myc水平升高中的作用。九、CCAT1通过let-7c与c-Myc相互调控在香烟烟雾抽提物所致HBE细胞恶性转化中的作用分别用 100pprn CCAT1 siRNA/Con siRNA 与 let-7c inhibitor/Con inhibitor 共转染或分别用50 nM c-Myc siRNA或Con siRNA转染处理T-HBE细胞,Western blot检测T-HBE细胞c-Myc水平;软琼脂集落形成实验观察T-HBE细胞恶性程度;Transwell实验观察T-HBE细胞侵袭迁移能力。以观察CCAT1通过let-7c与c-Myc相互调控对CSE所致HBE细胞恶性转化的影响。结果一、香烟烟雾抽提物对HBE细胞lncRNA与miRNA水平的影响结果发现20μg/mL CSE急慢性处理引起HBE细胞CCAT1、MALAT1、HOTAIR、miR-21 水平升高,1et-7c 和 miR-218 水平下降,,说明 CSE 引起 HBE细胞CCAT1水平升高和miR-218和let-7c水平降低。二、香烟烟雾抽提物对HBE细胞BMI1水平的影响结果发现20μg/mL CSE急性处理6 h或慢性处理20代后,HBE细胞BMI1水平显著高于处理前或同代对照组HBE细胞,并有一定的时间-效应关系。说明CSE处理可以引起HEB细胞BMI1水平升高。三、CCAT1调控miR-218水平对香烟烟雾抽提物所致HBE细胞BMI1水平升高的影响结果发现 miR-218 mimic 与 pGL3-CCAT1-WT 共转染后联合 20 μg/mL CSE处理组荧光素酶活性显著低于单独CSE处理组。通过siRNA下调CCAT1可阻滞CSE所致HBE细胞CCAT1和BMI1水平升高及miR-218水平降低;上调miR-218可阻滞CSE所致HBE细胞BMI1水平升高;与单独下调CCAT1联合CSE处理组相比,同时下调CCAT1和let-7c后联合CSE处理HBE细胞组的BMI1水平显著回升。说明CCAT1可能通过调控miR-218的表达影响其下游BMI1的水平。四、CCAT1通过miR-218调控BMI1在香烟烟雾抽提物所致HBE细胞恶性转化中的作用结果发现,与单独CSE处理HBE细胞组相比,通过siRNA下调CCAT1处理T-HBE细胞miR-218水平回升,同时BMI1水平下降,细胞集落形成数以及侵袭迁移细胞数显著低于单纯T-HBE细胞;而在下调CCAT1水平的基础上同时联合下调miR-218处理T-HBE细胞后,BMI1水平显著高于单独下调CCAT1处理T-HBE细胞,细胞集落形成数和侵袭迁移细胞数显著回升;下调BMI1后,T-HBE细胞的细胞集落形成数和侵袭迁移细胞数显著下降。说明CCAT1通过miR-218调控BMI1影响了 T-HBE细胞恶性程度和侵袭转移能力。五、香烟烟雾抽提物对HBE细胞c-Myc水平的影响结果发现20μg/mL CSE急性处理6 h或慢性处理20代后,HBE细胞c-Myc水平显著高于处理前或同代对照HBE细胞,并具有一定的时间-效应关系。说明CSE处理引起HEB细胞c-Myc 水平升高。六、c-Myc在香烟烟雾抽提物所致HBE细胞CCAT1水平升高中的作用结果发现20 μg/mL CSE处理组c-Myc和CCAT1水平显著高于对照HBE细胞,通过siRNA关闭c-Myc可阻滞20 μg/mL CSE所致HBE细胞c-Myc和CCAT1水平升高;20μg/mL CSE急性处理HBE细胞后c-Myc与CCAT1启动子区结合增加。说明c-Myc在CSE所致HBE细胞CCAT1水平升高中具有重要作用。七、let-7c在香烟烟雾抽提物所致HBE细胞c-Myc水平升高中的作用结果发现上调let-7c可阻滞20 μg/mL CSE所致HBE细胞c-Myc水平升高;let-7c mimic 与 pmirGLO-c-Myc-3’UTR-WT 共转染后联合 20 μg/mL CSE 处理组荧光素酶活性显著低于单独CSE处理组。说明let-7c通过与c-Myc的3’-UTR区结合抑制CSE处理HBE细胞c-Myc的表达。八、CCAT1在香烟烟雾抽提物所致HBE细胞c-Myc水平升高中的作用结果显示通过siRNA下调CCAT1可显著阻滞20 μg/mL CSE所致HBE细胞CCAT1 和c-Myc水平升高;let-7c mimic与pGL3-CCAT1-WT共转染后联合20μg/mL CSE处理组荧光素酶活性显著低于单独CSE处理组;CCAT1 siRNA和let-7c inhibitor联合CSE处理组的c-Myc水平显著高于单独CCAT1 siRNA联合CSE处理组,同时let-7c水平显著下降。说明CCAT1可能通过与let-7c结合从而引起其下游c-Myc的水平变化。九、CCAT1通过let-7c与c-Myc相互调控在香烟烟雾抽提物所致HBE细胞恶性转化中的作用结果发现,通过siRNA下调CCAT1可使T-HBE细胞c-Myc水平、细胞集落形成数和侵袭迁移细胞数显著下降;而在利用siRNA下调CCAT1水平的基础上联合let-7c inhibitor处理T-HBE细胞后,c-Myc水平、细胞集落形成数和侵袭迁移数显著高于单独CCAT1 siRNA处理T-HBE细胞组。说明CCAT1可能通过let-7c调控c-Myc影响了 T-HBE细胞的恶性程度和侵袭转移能力。结论1、CSE引起HBE细胞CCAT1水平升高及miR-218和let-7c水平降低。2、CCAT1通过miR-218调控BMI1在CSE所致HBE细胞恶性转化过程中发挥重要作用。3、CCAT1与c-Myc相互调控参与了 CSE所致HBE细胞恶性转化过程。