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一、研究背景类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性、炎症性自身免疫疾病,可表现为不可逆的软骨侵蚀、骨质破坏,滑膜的慢性炎症、滑膜增生、血管翳是RA发生发展中的重要一环,成纤维细胞样滑膜细胞(Fibrolast-like synoviocytes,FLS)的过度激活,在各种炎症及细胞因子的作用下,诱导巨噬细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润,被认为在RA的发病机制中扮演重要角色。而RA-FLS的激活的机制的研究热点通路就是Wnt信号通路,研究者认为在RA的发生发展过程中存在Wnt信号通路的过度激活。环指蛋白43(Ring finger protein43,RNF43)是一种新的Wnt信号通路抑制剂,在结构上它是一种跨膜的E3泛素化连接酶,功能上可以与Wnt受体蛋白结合,并诱导其泛素化降解,从而抑制该通路的活性,关于RNF43的研究热点,目前主要在肿瘤的基础研究领域,关于RA中RNF43所扮演的作用目前尚未开展研究,因此本课题率先开展了在RA患者中观察RNF43的表达水平的检测,RA-FLS中RNF43的调控功能,以及体内进一步探讨RNF43对胶原诱导性关节炎小鼠的影响,并推测其可能存在的调控方式。二、研究目的第一部分:观察RNF43在类风湿关节炎(RA)、骨关节炎(OA)、创伤患者滑膜组织及细胞中表达情况。第二部分:体外探讨RNF43对成纤维样滑膜细胞(FLS)增殖、凋亡、炎症反应的作用,以及体内探讨RNF43对CIA模型关节肿胀、滑膜炎症及骨质破坏的影响。三、研究方法第一部分:首先与骨关节科合作收集类风湿关节炎(RA)、骨关节炎(OA)、创伤(Trauma)患者滑膜,提取RA-FLS,并鉴定RA-FLS是否真实;其次,观察三者滑膜在病理切片上表现,并做好统计学分析;最后,观察RNF43在三者滑膜中表达水平。第二部分:首先,构建RNF43质粒表达载体,感染RA-FLS;其次,观察感染后的RA-FLS的增殖、周期、迁移及炎症因子表达水平;最后,构建CIA模型,进行慢病毒体内实验,并研究CIA模型关节、滑膜及体内炎症因子水平。四、结果第一部分:FLS通过酶消法成功获得,并鉴别了其来源,选用3-6代细胞进行实验。RNF43在RA、OA及创伤患者中均有表达,其中RA与创伤患者相比,RNF43的表达升高的更为明显且存在统计学差异,但是RA与OA相比,两者的RNF43表达水平相近,无明显差异。我们推测出现此种现象的原因可能与RA及OA患者中Wnt信号通路的过度活化,从而引起RNF43的反馈性表达增加。第二部分:通过第一部分,成功获得RA-FLS细胞,完成慢病毒的包装,(1)慢病毒当感染复数(Multiplicity of infection,MOI)I=30时,感染效率可以满足实验要求。(2)与LV-ctr组相比较,LV-RNF43可以降低RA-FLS细胞活性,相比Sh-ctr组,ShRNF43可以提升细胞活性,行TNF-α刺激后,两组细胞活性均有下降,但趋势较前相同。(3)与LV-ctr相比,LV-RNF43组可以明显促进RA-FLS凋亡,与Sh-ctr相比,Sh-RNF43组抑制RA-FLS细胞的凋亡。(4)与LV-ctr相比,LV-RNF43的过表达可以降低IL-1β、IL-6、IL-8 m RNA及表达水平,与Sh-ctr相比,Sh-RNF43组可以促进IL-1β、IL-6、IL-8 m RNA及表达水平。(5)LV-ctr组对比LV-RNF43组RA-FLS的迁移率下降,Sh-RNF43组RA-FLS的迁移作用与Sh-ctr组相比未见明显变化。(6)在CIA模型构建中Sh-ctr与LV-ctr组,关节炎评分相近;LV-RNF43组CIA关节炎评分于第40天左右达到高峰,且随时间推移,评分逐渐下降且明显低于LV-ctr评分;Sh-RNF43组CIA关节炎评分于32天左右评分升高速度加快,于第49天达到高峰,且评分高于Sh-ctr.(7)注射剂量为单膝10ul慢病毒可以达到成功感染CIA的剂量。(8)Western blot检测膝关节内病毒的表达量,LV-RNF43表达量高于LV-ctr组,Shctr组高于Sh-RNF43组。(9)LV-RNF43与LV-ctr相对比,可发现在LV-RNF43组中的小鼠膝关节内病理改变程度较对照组轻,LV-RNF43关节炎评分为3.2±0.45分,LVctr评分为4.6±.54分,表明促进RNF43表达可以减轻关节炎症。(10)CIA模型鼠体内实验时:与LV-ctr组比较,LV-RNF43组中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量下降,与Sh-ctr相比,Sh-RNF43组血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6含量升高,这表明促进RNF43的表达可以抑制CIA模型鼠内炎症因子的,抑制RNF43的表达会促进CIA模型鼠内炎症因子的表达。五、结论本课题组通过人体组织标本、体外实验、动物模型构建,完成了组织标本的确定,探讨了RNF43对RA-FLS细胞的生物活性的影响,并再次于CIA模型体内进行验证。我们研究发现,RNF43在体内外都可以抑制RA-FLS的增殖及相关炎症因子的表达,因为RNF43是Wnt信号通路的抑制因子,而Wnt信号通路又与RA的发生发展相关,因此我们得出可能通过该信号调节通路调控RA的发生、发展,我们认为RNF43有可能成为RA诊断及治疗的潜在靶点。