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目的：
创伤后应激障碍（post-traumaticstressdisorder，PTSD）是对严重应激源的一种异常精神反应，是应激精神疾病中最为典型的一种，随着战争、社会暴力事件、重大交通事故和自然灾害等创伤意外的增多，PTSD发病率越来越高。现今，PTSD以其发病率、患病率高、慢性病程、难以治愈等特点，严重影响人们身心健康而备受关注。
在严重创伤应激急性期，边缘系统为应激应答敏感区，其功能和应激联系密切。杏仁核作为边缘系统的重要组成部分，在恐惧、发怒和情感记忆中起重要的作用，因此可能在PTSD的发病中起重要作用。
杏仁核是恐惧形成和表达的关键中枢。研究报道，Ca2+-CaM-CaMKIIα信号途径在活动依赖性长时程核基因表达、中枢神经可塑性、学习与记忆、精神与行为等多种认知活动中有重要作用。近年的研究显示，PTSD大鼠杏仁核神经元发生凋亡。线粒体在细胞凋亡的发生中起重要的作用，Caspase9与凋亡启动有关，在细胞凋亡的调控中发挥着重要的作用。细胞凋亡时，线粒体的作用不容忽视，作为线粒体标志酶细胞色素氧化酶（cytochromecoxidase，COX）其活性变化可体现线粒体的功能状态，也反应细胞凋亡的状态。
“单一连续刺激（singleprolongedstress，SPS）”SPS动物模型是目前探讨PTSD发病机制的较理想的实验模型，该方法已经被国际所认同。因此本研究采用SPS方法刺激大鼠制作PTSD模型，并研究刺激后各时间段Ca2+-CaM-CaMKIIα的改变及线粒体标志性酶细胞色素氧化酶的表达，同时检测凋亡蛋白酶Caspase9的改变，旨在探讨PTSD大鼠杏仁核恐惧增强学习记忆改变的发生机制，为揭示PTSD的发病机制提供实验依据。
实验方法：
1、模型制作及分组
采用2005年日本文部省召开的国际PTSD科学会议确定的SPS模型。其具体方法是将大鼠按连续进行下述步骤处理：固定刺激2小时后，立即强迫性游水20min，水深40cm，水温25℃；休息15min；乙谜麻醉至意识丧失；无干扰空间常规喂养。
随机分为5组，即正常对照组及SPS1d、4d、7d和14d组。
2、杏仁核细胞内游离Ca2+浓度检测
细胞内游离Ca2+浓度检测：取正常对照组及SPS1d、4d、7d、14d大鼠，经0.4％戊巴比妥麻醉，开颅取双侧杏仁核100mg，常规方法制备106～107/ml的细胞悬液，加入1mmol/LFura-2/AM置于37℃避光孵育40min；荧光分光光度计检测。
3、CaM、CaMKIIα的免疫组化
免疫组化：分别选取各组大鼠灌流固定、沉糖的大脑，制作冰冻切片，分别用PV法进行杏仁核的CaM、CaMKIIα免疫组织化学染色，DAB显色，中性树胶封片，光学显微镜观察，摄片。
4、CaM、CaMKIIα及Caspase-9的WesternBlotting、RT-PCR
WesternBlotting：分别取新鲜杏仁核经匀浆、超声粉碎后高速低温离心，提取上清蛋白，电泳，转膜，经封闭后分别加一抗4℃过夜；HRP标记IgG孵育2h，ECL发光，检测条带各光密度值。
RT-PCR：断头取脑分离杏仁核，提取总RNA，进行逆转录和PCR扩增。扩增结束后进行凝胶电泳，成像并进行积分光密度分析。
5、COX的酶组化及透射电镜技术观察
灌流取冰冻切片，下降梯度PBS脱糖，孵育液37℃孵育半小时，甘油明胶封片，光镜下观察，摄片。
常规电镜制样，倒扣包埋、聚合、半薄切片定位，AO超薄切片机进行超薄切片，透射电镜下观察。
6、杏仁核Caspase9免疫荧光
免疫荧光：分别选取各组大鼠灌流固定、沉糖的大脑，制作石蜡切片，然后进行荧光染色，甘油PBS封片，荧光显微镜（FM）下观察，摄片。
结果：
1、杏仁核细胞内游离Ca2+浓度检测的结果
应激组大鼠杏仁核细胞内游离Ca2+浓度于实验后12h明显高于对照组，24h增至高峰，至4d时仍明显高于对照组，14d恢复至正常。
2、CaM及CaMKIIα的免疫组化、WesternBlotting及RT-PCR的结果
PTSD大鼠杏仁核神经元CaM的各项表达于SPS4d达高峰，SPS7d和SPS14d逐渐下降；CaMKIIα的各项表达均于SPS1d时最低，之后逐渐升高。
3、COX酶组化及透射电镜结果
光镜下，与正常对照组相比，SPS组杏仁核神经元COX阳性表达明显减少。电镜下，SPS后，杏仁核神经元出现线粒体肿胀，COX从线粒体释放入胞浆。
4、Caspase9的免疫荧光、WesternBlotting及RT-PCR的结果
PTSD大鼠杏仁核神经元caspase9的各项表达于SPS刺激后，出现逐渐上调的趋势，SPS7d时达到高峰。
结论：
1、PTSD大鼠杏仁核神经元Ca2+-CaM-CaMKIIα信号途径调控紊乱。
2、PTSD大鼠杏仁核COX酶从线粒体释放入胞质，Caspase9表达上调，介导杏仁核神经元凋亡的发生。
创伤后应激障碍（post-traumaticstressdisorder，PTSD）是对严重应激源的一种异常精神反应，是应激精神疾病中最为典型的一种，随着战争、社会暴力事件、重大交通事故和自然灾害等创伤意外的增多，PTSD发病率越来越高。现今，PTSD以其发病率、患病率高、慢性病程、难以治愈等特点，严重影响人们身心健康而备受关注。
在严重创伤应激急性期，边缘系统为应激应答敏感区，其功能和应激联系密切。杏仁核作为边缘系统的重要组成部分，在恐惧、发怒和情感记忆中起重要的作用，因此可能在PTSD的发病中起重要作用。
杏仁核是恐惧形成和表达的关键中枢。研究报道，Ca2+-CaM-CaMKIIα信号途径在活动依赖性长时程核基因表达、中枢神经可塑性、学习与记忆、精神与行为等多种认知活动中有重要作用。近年的研究显示，PTSD大鼠杏仁核神经元发生凋亡。线粒体在细胞凋亡的发生中起重要的作用，Caspase9与凋亡启动有关，在细胞凋亡的调控中发挥着重要的作用。细胞凋亡时，线粒体的作用不容忽视，作为线粒体标志酶细胞色素氧化酶（cytochromecoxidase，COX）其活性变化可体现线粒体的功能状态，也反应细胞凋亡的状态。
“单一连续刺激（singleprolongedstress，SPS）”SPS动物模型是目前探讨PTSD发病机制的较理想的实验模型，该方法已经被国际所认同。因此本研究采用SPS方法刺激大鼠制作PTSD模型，并研究刺激后各时间段Ca2+-CaM-CaMKIIα的改变及线粒体标志性酶细胞色素氧化酶的表达，同时检测凋亡蛋白酶Caspase9的改变，旨在探讨PTSD大鼠杏仁核恐惧增强学习记忆改变的发生机制，为揭示PTSD的发病机制提供实验依据。
实验方法：
1、模型制作及分组
采用2005年日本文部省召开的国际PTSD科学会议确定的SPS模型。其具体方法是将大鼠按连续进行下述步骤处理：固定刺激2小时后，立即强迫性游水20min，水深40cm，水温25℃；休息15min；乙谜麻醉至意识丧失；无干扰空间常规喂养。
随机分为5组，即正常对照组及SPS1d、4d、7d和14d组。
2、杏仁核细胞内游离Ca2+浓度检测
细胞内游离Ca2+浓度检测：取正常对照组及SPS1d、4d、7d、14d大鼠，经0.4％戊巴比妥麻醉，开颅取双侧杏仁核100mg，常规方法制备106～107/ml的细胞悬液，加入1mmol/LFura-2/AM置于37℃避光孵育40min；荧光分光光度计检测。
3、CaM、CaMKIIα的免疫组化
免疫组化：分别选取各组大鼠灌流固定、沉糖的大脑，制作冰冻切片，分别用PV法进行杏仁核的CaM、CaMKIIα免疫组织化学染色，DAB显色，中性树胶封片，光学显微镜观察，摄片。
4、CaM、CaMKIIα及Caspase-9的WesternBlotting、RT-PCR
WesternBlotting：分别取新鲜杏仁核经匀浆、超声粉碎后高速低温离心，提取上清蛋白，电泳，转膜，经封闭后分别加一抗4℃过夜；HRP标记IgG孵育2h，ECL发光，检测条带各光密度值。
RT-PCR：断头取脑分离杏仁核，提取总RNA，进行逆转录和PCR扩增。扩增结束后进行凝胶电泳，成像并进行积分光密度分析。
5、COX的酶组化及透射电镜技术观察
灌流取冰冻切片，下降梯度PBS脱糖，孵育液37℃孵育半小时，甘油明胶封片，光镜下观察，摄片。
常规电镜制样，倒扣包埋、聚合、半薄切片定位，AO超薄切片机进行超薄切片，透射电镜下观察。
6、杏仁核Caspase9免疫荧光
免疫荧光：分别选取各组大鼠灌流固定、沉糖的大脑，制作石蜡切片，然后进行荧光染色，甘油PBS封片，荧光显微镜（FM）下观察，摄片。
结果：
1、杏仁核细胞内游离Ca2+浓度检测的结果
应激组大鼠杏仁核细胞内游离Ca2+浓度于实验后12h明显高于对照组，24h增至高峰，至4d时仍明显高于对照组，14d恢复至正常。
2、CaM及CaMKIIα的免疫组化、WesternBlotting及RT-PCR的结果
PTSD大鼠杏仁核神经元CaM的各项表达于SPS4d达高峰，SPS7d和SPS14d逐渐下降；CaMKIIα的各项表达均于SPS1d时最低，之后逐渐升高。
3、COX酶组化及透射电镜结果
光镜下，与正常对照组相比，SPS组杏仁核神经元COX阳性表达明显减少。电镜下，SPS后，杏仁核神经元出现线粒体肿胀，COX从线粒体释放入胞浆。
4、Caspase9的免疫荧光、WesternBlotting及RT-PCR的结果
PTSD大鼠杏仁核神经元caspase9的各项表达于SPS刺激后，出现逐渐上调的趋势，SPS7d时达到高峰。
结论：
1、PTSD大鼠杏仁核神经元Ca2+-CaM-CaMKIIα信号途径调控紊乱。
2、PTSD大鼠杏仁核COX酶从线粒体释放入胞质，Caspase9表达上调，介导杏仁核神经元凋亡的发生。