论文部分内容阅读
背景和意义肝门部胆管癌是一个不常见但预后差且致命的恶性肿瘤,约占肝外胆管癌的50%-70%,近30年来其发病率在国内外均有增高趋势。手术切除(包括肝部分切除或者肝移植)是唯一有效的根治方法。然而,因为肿瘤局部侵袭邻近组织和器官的特性以及通常剩余肝功能的不足,少数病人能够适合行根治性手术。即使行根治切除术后复发率仍很高。辅助治疗(包括化疗和放射治疗)并没有清楚地表明能够减少肿瘤复发的风险。目前用于肝门部胆管癌早期诊断及预后评估的、理想的、具有高敏感性及特异性的标志物尚未发现或筛选出来。因此,阐明肝门部胆管癌发病及恶性行为的分子生物学机制,有助于发现和筛选特异性的分子靶点,对其早期发现、早期诊断、早期干预治疗和患者预后评估具有重要意义。肝癌衍生生长因子(HDGF)是从肝癌细胞系Huh-7的条件培养液中提取出一种具有促进细胞有丝分裂活动的肝素结合蛋白。多项研究证实HDGF具有多种生物学功能,包括促进多种细胞增殖和DNA的合成,参与肝、肺、肾、心血管、消化道等组织器官生长发育的调控,维持正常细胞的功能,营养神经和修复组织。同时,HDGF在多种肿瘤组织中的表达异常增高且与肿瘤的预后、复发以及一些不良的临床病理特征关系密切。研究证明HDGF具有增强肿瘤恶性生物学行为,包括增殖、迁移、侵袭和血管生成,同时通过诱导血管内皮生长因子(VEGF)生成。但目前尚未见HDGF在肝门部胆管癌中的报道,因而研究HDGF在肝门部胆管癌的表达以及在恶性生物学行为中的作用机制具有重要意义。肿瘤血管生成程度与肿瘤的侵袭性和临床结局密切相关,可以用来预测患者肿瘤的复发。VEGF是作为目前已知的最强的促血管生成因子,研究报道VEGF在乳腺癌中、非小细胞肺癌、肝癌和胃癌中表达水平的高低与基质金属蛋白酶-9(MMP-9)密切相关。胃癌是世界范围内第四大常见和第二大癌症相关死亡原因的恶性肿瘤,具有预后差、死亡率的特点。淋巴结转移是胃癌患者一个重要的预后因素,排除淋巴结转移来研究pN0胃癌的复发和预后具有重要意义,因而我们课题组联合检测VEGF和MMP-9表达水平以期能否预测肿瘤的复发和预后。第一部分HDGF在肝门部胆管癌中的表达及临床意义目的研究HDGF和VEGF在肝门部胆管癌的表达情况,以及它们与临床病理特征和预后的关系。方法采用链霉亲和素-过氧物酶的免疫组织化学法检测58例肝门部胆管癌患者术后标本中HDGF和VEGF的表达情况；结合免疫组化结果分析了HDGF、VEGF二者与患者的临床病理特征之间的关系；并同时生存分析判断其对肝门部胆管癌患者预后的影响。结果HDGF和VEGF在肝门部胆管癌组织中表达的阳性率分别为46.6%和72.4%。Spearman等级相关分析显示HDGF和VEGF的表达呈正相关(r=0.370,P=0.004)。HDGF的表达与患者的年龄和组织类型有关。HDGF表达阳性的患者总生存率明显比HDGF表达阴性的患者低(35.7%versus73.3%,P=0.003)。多因素分析表明HDGF是一个独立的预后因素。结论HDGF与VEGF的表达密切相关,且HDGF可以作为肝门部胆管癌患者术后有用的预后指标。第二部分HDGF在肝门部胆管癌细胞株FR0201恶性行为中的体外研究目的研究HDGF在肝门部胆管癌细胞株FRH0201的增殖、迁移、侵袭和血管形成中所起的作用。方法转染HDGF siRNA入细胞后,用Real time PCR和Western blot检测转染后细胞内HDGF表达被抑制的效果；MTT方法检测细胞增殖能力的变化；细胞划痕实验和细胞迁移实验检测细胞迁移能力的变化；Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化；体外血管形成实验检测促血管形成能力的变化。结果转染48h后用Real time PCR和Western blot检测发现FRH0201细胞HDGF的表达在mRNA和蛋白水平均被明显抑制；抑制了HDGF的表达后,MTT检测发现细胞的增殖能力仅为对照组细胞的46.0%(P<0.01)；细胞划痕实验结果显示细胞的迁移能力仅为对照组的41.7%(P<0.05)；细胞迁移实验显示细胞的迁移能力仅为对照组的26.5%(P<0.01)；Transwell小室侵袭实验结果显示细胞的侵袭能力为对照组细胞的22.7%(P<0.01)；体外血管形成实验显示血管形成能力仅为对照组细胞的35.0%(P<0.01)。结论HDGF对肝门部胆管癌细胞FRH0201的增殖、迁移、侵袭和血管形成等恶性生物学行为起着重要的作用,抑制了HDGF的表达后,FRH0201细胞的恶性生物学行为明显下调。第三部分VEGF在pN0胃癌的复发及预后的研究目的研究VEGF和MMP-9在pN0胃癌的表达情况,以探讨二者相关性及与临床特征及预后的关系。方法采用链霉亲和素-过氧物酶的免疫组织化学法检测55例pN0胃癌患者术后标本中VEGF和MMP-9的表达情况；分析二者的相关性、以及与患者的临床病理特征和生存之间的关系。结果VEGF和MMP-9在pN0胃癌组织中表达的阳性率分别为43.6%和29.1%,Spearman等级相关分析显示VEGF和MMP-9的表达呈正相关(r=0.324,P=0.016)。单因素分析表明,VEGF、MMP-9、肿瘤血管浸润、T分期、大小与患者的肿瘤复发、疾病特异性和总生存率明显相关。VEGF阳性表达的患者5年肿瘤复发率、疾病特异性和总生存率均高出VEGF阴性表达的患者。多因素分析显示,除了T分期在疾病特异性生存率无意义,VEGF表达,血管浸润、T分期(浆膜浸润)和肿瘤大小是pN0胃癌患者的肿瘤复发、疾病特异性和总生存率的独立预后因素,结论VEGF表达、血管浸润、浆膜浸润和肿瘤大小可作为有用的指标用来预测pN0胃癌患者术后的肿瘤复发和预后。此外,VEGF和MMP-9可能在肿瘤血管生成、发生和发展中具有协同作用。因此,干扰VEGF和MMP-9的表达可能是未来肿瘤治疗的一个新靶点。