橘小实蝇Bactrocera dorsalis (Hendel)是国内重要的果蔬害虫,能取食多种水果和蔬菜,给果蔬业造成严重的经济损失。橘小实蝇转录组文库的构建为其在分子层面上的研究提供了大量有用的信息,筛选合适的分子靶标并研究其功能,能为有效防治橘小实蝇提供理论依据。Rab蛋白是一类小分子GTP结合蛋白,在囊泡运输和信号传递中发挥了重要作用。Rabll是Rab家族的一员,其在昆虫发育中的发挥诸多作用,但Rab11在昆虫变态发育中的功能尚不清楚。本研究选取了橘小实蝇转录组文库中的Rab基因家族作为研究对象,利用实时荧光定量PCR和RNAi等分子生物学技术研究了其表达模式及在橘小实蝇变态发育中的作用。研究结果不仅有助于提高我们对橘小实蝇发育分子机制的理解,而且为防治橘小实蝇提供了新思路和新途径。1.橘小实蝇转录组文库中差异表达基因的验证。通过实时荧光定量PCR对橘小实蝇转录组文库中参与发育和生殖相关的8个差异表达基因表达模式进行了验证,表明了该文库信息的准确性和可靠性,筛选出在变态时期高表达的Rab家族基因作为候选基因进行深入研究。2.橘小实蝇Rab家族基因生物信息学分析及表达模式研究。同源比对结果表明,橘小实蝇同家族Rab基因氨基酸序列均与近缘昆虫有着很高的相似性,相似度最高为BdRabll,与黑腹果蝇Drosophila melanogaster DmRabll的相似度达到99%,最低为BdRab18、BdRab40,分别对应刺舌蝇Glossina morsitans Rabl8、黑腹果蝇D. melanogaster DmRab40相似度为85%、85%。对橘小实蝇同家族Rab基因的氨基酸序列进行比对,发现它们都具有GTP/Mg2+结合位点和Rab蛋白分子特征序列。系统发育树分析发现橘小实蝇同家族Rab基因均与黑腹果蝇D. melanogaster同源基因进化距离最接近。对橘小实蝇Rab家族基因在不同发育阶段的表达模式进行研究,发现各基因表达模式有差异。BdRabl在三龄和蛹期表达量最高,BdRab5在成虫期高表达,BdRab7在预蛹期高表达,BdRabll、 BdRab14、 BdRab18均在三龄幼虫期表达量显著上调,BdRab35在三龄和蛹期大量表达,BdRab40在三龄幼虫和成虫期大量表达,暗示各基因在橘小实蝇不同发育过程中发挥功能。三龄幼虫是化蛹前的准备阶段,完全变态昆虫蛹期进行着剧烈的旧组织解离和新组织的发生,需要大量营养物质和能量,化蛹前昆虫大量取食并迅速生长,形态体积增大,为化蛹做好营养积累的准备。本研究表明,BdRabll、 BdRab14、BdRab18可能参与化蛹的准备活动。3. BdRabll组织表达模式和功能研究。我们选取BdRabll作为目标基因,研究其在橘小实蝇发育中的功能。克隆得到了BdRabll基因完整ORF,大小为642bp,编码213个氨基酸。对BdRabll在不同组织部位的表达模式进行研究,发现BdRabll在三龄幼虫脂肪体中的表达量显著高于二龄幼虫脂肪体和预蛹脂肪体(P<0.05)。利用RNAi技术干扰了三龄幼虫BdRabll基因,造成其表达显著下调(P<0.01),10ng/μl dsRNA处理组下调了65.7%。BdRabll基因下调一方面使得三龄幼虫脂肪体组织形态发生变化,与对照组相比,处理组脂肪体组织的形态有显著不同,组织内部通透不饱满,另一方面使得橘小实蝇的羽化率受到影响,处理组的羽化率(58.5%)显著(P<0.05)低于对照组的羽化率(85.9%和91.1%)。但BdRabll基因下调对成虫死亡率影响并不明显。我们推断BdRabll参与了三龄幼虫脂肪体细胞营养的积累和贮存,从而影响到脂肪体组织的形态和橘小实蝇的羽化。已有报道表明,Rabll蛋白通过细胞内囊泡运输以及细胞外胞吞作用的形式输送物质,所以我们认为BdRabll通过调控脂肪体细胞营养的储存供应和输送物资影响脂肪体组织形态及羽化过程。然而,BdRabll在这一事件中的分子机制以及上下游的信号通路具体情形还不得而知,有待进一步研究。