不同来源花色苷提取物的结构差异谱及其降糖降脂作用评价

来源 :湖北中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:q569293407
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本文研究了12种不同来源的花色苷提取物的组成成分及其对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和脂肪酶的体外抑制作用和作用机理,并筛选其中3种样品进行HepG2细胞体外糖消耗试验和1种样品进行高脂小鼠模型的体内降脂作用评价。本文主要研究结果如下:1不同来源的花色苷提取物的成分分析和结构鉴定采用化学方法分析了12种样品的总酚酸、总黄酮和总花色苷的含量,利用高效液相色谱技术(HPLC-PDA)比较不同来源提取物中花色苷和辅色素的种类及含量差异,结合超高液相串联四级杆时间飞行质谱(UPLC-QTOF-MS/MS)对其花色苷和辅色素的化学结构进行系统地鉴定。结果表明1、2、3、9、10号样品中总酚酸含量较高(>40 mg of GAE/100 mg);10号样品中总黄酮最高(172.4±2.95 mg of rutin/100 mg),而1-3号样品中总黄酮较低;8号样品中花色苷含量最高(30.218±0.72 mg/100 mg),10号样品中花色苷含量较低(4.087±0.13 mg/100 mg)。比较520 nm波长下的液相图,我们可以直观对比12种样品中花色苷的含量和种类的差异,结果显示1-3号样品中的花色苷种类多达18种,4-12号样品中花色苷含量较高仅以1种花色苷为主;对比280 nm波长下的液相图,我们发现10号和12号样品的辅色素种类多且所占总峰面积较大。结合液质联用技术对4-12号样品进行结构解析,鉴定出3种花色苷及10种酚类化合物的结构,其中4-12号样品中的主要花色苷为矢车菊素-3-O-半乳糖苷/葡萄糖苷,其辅色素以咖啡酰奎宁酸和芦丁为主;10号样品中解析到原花青素单倍体、二聚体和三倍体。2不同来源的花色苷提取物对糖脂消化关键酶抑制活性筛选通过比较相同浓度下的不同来源花色苷提取物对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和脂肪酶活性的影响,筛选出活性最优品种的花色苷提取物;进一步对有良好α-葡萄糖苷酶抑制效果的1-3号样品进行系统的成分研究和酶活抑制作用比较;在此基础上,拟以10号样品为研究模版,系统研究其对α-葡萄糖苷酶的抑制类型和抑制动力学特征。结果表明:1、2、3、8、10号样品对α-葡萄糖苷酶均显示出较好的抑制效果;与同浓度的阳性组阿卡波糖(40.38±0.70%)比较,10号样品对酶的抑制率达到94.57±1.43%,抑制作用最优,2、3号样品对酶的抑制率达到60%以上;5号样品(35.90±3.00%)和10号(35.56±6.16%)样品对α-淀粉酶的活性有显著影响;同时5号样品对脂肪酶显示较强的抑制作用。基于成分分析和样品对糖脂消化关键酶的活性结果,采用半制备HPLC技术将1-3号样品分为辅色素片段和花色苷片段。在花色苷片段中解析到18种花色苷结构,1号样品种含有4种酰基化花色苷;辅色素片段以酚酸类的羟基肉桂酸化合物主,在3种辅色素片段解析到4种环烯醚萜类化合物。α-葡萄糖苷酶抑制结果显示1-3号样品蓝莓花色苷提取物的剂量与酶抑制呈现较好的线性关系,进一步研究显示花色苷片段对α-葡萄糖苷酶的活性影响较小、辅色素片段的抑制作用较强且有明显量效关系。以总酚酸成分含量最高的10号样品为模版,系统评价其对α-葡萄糖苷酶的抑制类型和抑制动力学特征。结果显示:10号样品的半数抑制浓度IC50值为11.37μg/mL;10号样品对α-葡萄糖苷酶的抑制反应为可逆性反应;Lineweaver-Burk双倒数图显示10号样品对α-葡萄糖苷酶抑制机理表现为反竞争性抑制。3 HepG2细胞模型研究1-3号样品对细胞葡萄糖消耗活力的影响利用正常HepG2细胞葡萄糖消耗模型和胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗模型,研究1-3号样品对细胞葡萄糖消耗活力的影响。首先通过探究不同浓度的胰岛素诱导和不同浓度的葡萄糖诱导HepG2细胞转变为胰岛素抵抗HepG2细胞,确定胰岛素抵抗HepG2细胞模型的最佳方案为:1×10-8 mol/L胰岛素,孵育24 h。细胞活力实验结果发现:3种样品在200μg/mL时对细胞增殖有一定影响,其中2号和3号样品在800μg/mL的样品浓度时,细胞存活率低于50%;胰岛素在1×10-9 mol/L开始对细胞增殖有明显促进;葡萄糖在22-99 mmol/L时对HepG2细胞增殖均无显著性影响。在正常HepG2细胞葡萄糖消耗模型中,1-3号样品在7.8125-31.25μg/mL时均不同程度促进了细胞糖消耗量,其中1号样品在15.625μg/mL时就显著增加葡萄糖的消耗,2、3号样品均在31.25μg/mL时表现出明显差异;在胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗模型中,1-3号样品在7.8125-31.25μg/mL范围内不同程度促进了细胞糖消耗量,且与剂量成正比关系,在31.25μg/mL达到促进最大值,与模型组比较均有极显著差异,说明1-3号蓝莓花色苷提取物能较好地改善胰岛素抵抗HepG2细胞的糖消耗量。4 5号样品对高脂模型小鼠的体内降脂作用以5号样品为研究材料,考察其在高脂饲料诱导的肥胖小鼠动物模型中的降脂效果。研究结果表明:5号样品能有效减少小鼠的膳食摄入量,高剂量可一定程度减轻小鼠体重并能显著升高小鼠血清中的HDL-C含量;脏器指数显示5号样品能显著降低小鼠的肝脏、附睾脂肪、肾周脂肪含量;肝脏形态学表明5号样品高低剂量组的脂滴数量和炎症细胞较模型组大大减少,细胞形态较为正常;小鼠第6周和第8周粪便的胆固醇和总胆汁酸的含量测定,结果显示第8周时高剂量的5号样品可极显著地增加小鼠粪便中的胆固醇含量;低剂量组的5号样品对小鼠两周抽取的粪便的总胆汁酸含量均有极显著增加;空腹血糖测定表明5号样品对高脂小鼠的空腹血糖有一定的降低作用。综上所述,本研究初步探讨了不同来源的花色苷提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用及其作用机理,提示花色苷提取物中的辅色素(酚酸类物质)对该酶的抑制作用可能提供主要贡献;花色苷提取物能有效促进HepG2细胞的葡萄糖消耗,改善其胰岛素抵抗作用;动物实验研究表明花色苷提取物对高脂小鼠有一定的降脂作用。本论文旨在为花色苷提取物干预糖脂代谢的研究提供思路并奠定基础。
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