家蚕vasa基因的原位杂交研究

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本研究以家蚕胚胎为材料,进行冰冻切片,获得一系列不同发育时期的家蚕胚胎冰冻切片。对这些切片进行观察和研究,结果一方面印证和补充了前人关于家蚕胚胎发育的描述,另一方面为我们后一步利用原位杂交和RNAi等技术研究家蚕基因功能奠定重要基础。 取发育至35h、48h的家蚕胚胎,获得了部分连续的冰冻切片,结果表明,家蚕胚胎发育至背部表皮完全形成之前,胚胎呈现丰富的立体结构。结合前人的研究结果可知,家蚕胚胎发育从胚盘开始形成时起,胚盘细胞一边增殖,一边向蚕卵前端腹部逐渐迁移、收缩,随后形成胚带,继而胚体伸长、形成原沟和腹部表皮等,直至背部表皮形成后,胚胎基本保持幼虫期近圆筒状形态直到孵化。 vasa是生殖系决定重要成分之一,具有广泛的保守性。在果蝇中报道之后,陆续在其他昆虫、线虫、爪蟾、低等真核生物、植物乃至高等哺乳动物中发现其同源基因。本研究克隆了一条家蚕vasa cDNA片段,对其进行DIG标记,合成探针,对家蚕胚胎及幼虫生殖腺进行原位杂交。结果表明,家蚕vasa基因在幼虫期只在生殖系相关的细胞和组织中表达(如精原细胞,精囊,卵巢管等),而在其它组织细胞中不表达。家蚕vasa基因在发育胚胎的生殖系存在部位有明显的杂交信号。原位杂交结果提示,家蚕vasa基因在家蚕早期胚胎发育和生殖系的分化形成中发挥重要作用。 此外,在进行原位杂交的研究中,我们探索和建立了家蚕胚胎原位杂交的方法,并对其中关键的影响因素进行了优化。结果表明,影响原位杂交结果的因素十分复杂,主要有取材时期和方法、固定方法、酶消化浓度和时间、杂交温度、洗涤温度和染色时间等。因此,建立这样一种可重复的技术方法十分必要。
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