缺血性脑卒中是引起人类非自然死亡和致残的主要疾病之一。激肽释放酶一激肽系统(Kallikrein-kinin system，KKS)作为公认的炎症调节系统在缺血性脑血管病不同时期的病理过程中发挥多种重要作用。KKS系统中主要成分之一激肽释放酶又可分为组织型和血浆型两类。近年来在脑缺血实验研究及临床应用中均发现，其中的组织型Kallikrein(文中的Kallikrein均指组织型)对缺血状况下脑组织有明确的保护作用。然而，由于大分子物质难以逾越血脑屏障及生物膜，这就限制了许多大分子药物对神经系统疾病的治疗。近年建立的蛋白质转导(Protein transduction)或称为蛋白质治疗(Protein therapy)的技术不仅能使生物大分子高效地跨过血脑屏障和穿越生物膜进入细胞，而且能使进入胞内的生物大分子物质保持其原有的生物活性。 本研究首先构建了蛋白质转导域．激肽释放酶(Protein transductiondomain-kallikrein，PTD-kaUikrein)复合物，并对其穿透功能和生物毒性进行验证。为排除复杂体内环境的影响，在第二部分工作中，应用PTD-kallikrein及缓激肽受体B2的特异性抑制剂对缺糖、缺氧(Oxygen-glucose depriration，OGD)再复糖、复氧的体外培养神经元模型进行了干预，观察了PTD-kallikrein对该条件下培养的神经元保护作用，并探讨了其可能的作用机制。在第三部分工作中，我们又对局灶性脑缺血大鼠进行了干预，以进一步验证PTD-kaUikrein对脑缺血大鼠的脑保护作用和可能的机制。本研究拟通过了解PTD-kallikrein对脑缺血再灌注损伤的蛋白质治疗及作用机制，为脑缺血的治疗提供新的途径和方法。 第一部分PTD-kallikrein的合成及其对生物膜、血脑屏障通透功能的鉴定 人工合成PTD肽段(氨基酸序列：RRRRRRRRRGC)，用化学交联法构建PTD-kallikrein。将荧光标记的 PTD-kallikrein及Kallikrein分别孵育不同细胞，在荧光显微镜下观察两种荧光物质对生物膜的通透能力。正常大鼠尾静脉注射PTD-kallikrein及Kallikrein，2.5h后断头取脑组织匀浆，Western-blot测定脑内Kallikrein含量的变化，以观察其对血脑屏障的通透能力。另用不同浓度的PTD肽段分别孵育不同细胞，MTT法检测细胞生存率，观察PTD肽段对细胞是否有毒性作用。结果显示：1．PTD-kallikrein可以通过生物膜及跨越血脑屏障；2．PTD肽段本身对细胞无明显的毒性作用。 第二部分 PTD-kallikrein对缺糖、缺氧后再恢复的神经元的保护作用 原代培养大鼠皮层神经元，然后给予OGD1.5h后复糖、复氧。除对照组外，其余各干预阻在OGD前24h分别给予100nmol/l的B2受体抑制剂HOE140和/或10、50及100 nmol/l的PTD-kallikrein、Kallikrein，复糖、复氧后4h采用MTT法测定细胞生存率，TUNEL测定细胞凋亡。结果显示：1．PTD-kallikrein可显著提高缺糖、缺氧再复糖、复氧条件下培养的神经元生存率并减少其凋亡；2．B2受体抑制剂能明显抑制PTD-kallikrein对神经元的保护。 第三部分PTD-kallikrein对大鼠MCAO模型缺血再灌注损伤的保护作用 制作大鼠左侧大脑中动脉梗塞模型，缺血90min后恢复再灌流。除假手术组外，其余各干预阻分别在缺血再灌流后即刻尾静脉给予2ml/kg的生理盐水、0.75nmol/kg的B2受体抑制剂bradyzide和/或3.15×10<-2>nmol/kg的PTD-kallikrein、Kallikrein2生行干预。再灌流24h后处死动物，NSS量表测定神经功能评分,TTC染色测定梗死体积，ELISA测定细胞因子IL-1β、TNF-α及PGE<,2>的分泌。结果显示：1．PTD-kallikrein能显著改善脑缺血导致的神经功能障碍、减小梗死体积、抑制细胞因子IL-1β、TNF-α及PGE<,2>的的释放；2．B2受体抑制剂能明显抑制PTD-kallikrein的神经保护作用。 结论 1．PTD-kallikrein可以高效地通过生物膜及跨越血脑屏障且对细胞无明显毒性作用； 2．PTD-kallikrein对缺糖、缺氧再复糖、复氧条件下培养的神经元及大鼠MCAO模型缺血再灌注损伤均有一定的保护作用； 3．PTD-kallikrein的保护作用可能是通过B2受体的介导而发挥其功效的。