【摘 要】
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铜绿微囊藻PCC7806(Microcystis aeruginosa PCC7806)具有复杂的生活史和高效的碳浓缩能力,并释放微囊藻毒素作为防御,能够更好地应对自然界的胁迫,这使其成为蓝藻水华的优势种之一。目前蓝藻面临的自然界胁迫主要集中在营养胁迫,其中氮、磷元素作为限制蓝藻生长的关键营养元素,直接影响藻细胞的生理生态特性。但当前研究普遍停留在其生理变化的层面,对于分子机制的调控尚不清楚。因此
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铜绿微囊藻PCC7806(Microcystis aeruginosa PCC7806)具有复杂的生活史和高效的碳浓缩能力,并释放微囊藻毒素作为防御,能够更好地应对自然界的胁迫,这使其成为蓝藻水华的优势种之一。目前蓝藻面临的自然界胁迫主要集中在营养胁迫,其中氮、磷元素作为限制蓝藻生长的关键营养元素,直接影响藻细胞的生理生态特性。但当前研究普遍停留在其生理变化的层面,对于分子机制的调控尚不清楚。因此,研究长期缺氮、缺磷胁迫对蓝藻代谢的影响,对于了解缺氮、缺磷胁迫下蓝藻的适应机制具有重要意义。本研究首先探究了缺氮和缺磷胁迫下铜绿微囊藻PCC7806的生理和代谢响应,通过iTRAQ(Isotope tagging for relative and absolute protein quantitation)蛋白组学差异表达分析,确定了铜绿微囊藻PCC7806在缺氮和缺磷胁迫下的代谢转变,同时发现碳汇流向聚-β-羟基丁酸酯(Poly-β-hydroxybutyrate,PHB)的合成途径。PHB是环境胁迫条件下细菌中一种常见的储能物质,研究发现,部分蓝藻在氮、磷胁迫条件下会积累大量的PHB。目前,PHB因具有高分子材料的热塑性和独特的生物相容性、降解性,在材料,医学和环境等领域被广泛关注。本研究首次发现缺氮、缺磷胁迫下铜绿微囊藻PCC7806能够积累大量的PHB。因此,本研究对铜绿微囊藻PCC7806积累PHB的能力及其产生的PHB的机械性能,热稳定性,降解性等性能进行分析,表明了以铜绿微囊藻作为生产者用于生产PHB的潜力与PHB实际应用的可行性。具体实验结果如下:(1)缺氮和缺磷胁迫导致藻细胞增长速率减缓,指数生长期明显缩短,稳定期时生物量降低,表明胁迫下的藻细胞生长受到抑制。由此,利用iTRAQ蛋白组学进行深入分析,结果发现,在缺氮、缺磷培养的处理组中鉴定到417个具有显著表达差异的蛋白。基于GO和KEGG注释,这些差异表达的蛋白主要参与能量产生和转变,翻译和核糖体生物发生以及氨基酸转运代谢过程。将蛋白组学与生理结果结合分析发现,缺氮、缺磷胁迫诱导藻细胞产生微囊藻毒素(Microcystins,MCs)以应对不利的环境。能量代谢中与糖异生和淀粉合成相关酶的表达水平上调,说明藻细胞将能量以淀粉形式进行储存。在氨基酸代谢过程中,缺氮胁迫下的谷氨酸和精氨酸代谢活跃,导致乙酰辅酶A含量增加,最终推动PHB的合成;缺磷胁迫下则主要通过磷脂酰胆碱的降解合成三酰甘油。此外,藻细胞内的捕光蛋白、光合色素,光反应中心蛋白和卡尔文循环中关键酶表达均下调,导致光合作用速率降低;与核糖体合成以及转录翻译相关蛋白的水平受到抑制。综上所述,铜绿微囊藻PCC7806主要通过积累淀粉,微囊藻毒素,PHB和甘油三酯,降低光合作用和蛋白合成来调节细胞内代谢以响应缺氮、缺磷胁迫。(2)前期的结果发现铜绿微囊藻PCC7806在缺氮和缺磷胁迫下的代谢转向PHB合成途径。因此,本实验测定缺氮和缺磷培养30天后藻细胞内PHB含量和PHB合成相关基因(phaA,phaB,phaC,phaE)的表达量,结果表明缺氮和缺磷胁迫导致PHB含量相较于对照分别提高了 18.98倍和6.41倍;PHB合成相关基因显著上调表达2.7-4.6倍,这说明缺氮处理更利于藻细胞积累PHB。接着,通过红外光谱,X-射线衍射和核磁共振等分析方法对藻细胞内产生的PHB的官能团,晶体构型和碳氢结构进行鉴定,并与标准PHB比较。结果表明,所提取的样品PHB-MA为聚-β-羟基丁酸酯。最后,对PHB-MA进行机械性能,热性能,亲水性,降解性等性能分析,并与常规塑料比较。结果表明,PHB-MA的抗拉强度和拉伸断裂率分别比常规塑料低57.65%和84.71%,而杨氏模量高于常规塑料169.46%,说明PHB-MA韧性低,硬度高;PHB-MA的亲水角为97.4°比塑料的亲水角95.7°高,说明PHB疏水性强;PHB-MA的加工窗口的变化温度仅在154.2-273℃之间,远小于塑料在124.9-465℃的加工窗口说明PHB-MA加工窗口窄,加工温度要求低;PHB-MA的Tc为87.3℃,比塑料低20.89%,说明PHB-MA结晶能力强,硬度高;PHB-MA在50天后的降解率可达到9.55%,而塑料膜几乎未降解,说明PHB-MA具有可降解的能力。综上所述,PHB-MA具有硬、脆性质,加工温度要求低,疏水性好,结晶能力强,降解性能优异,更适用于作为工程塑料使用。
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