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古树的寿命可长达上百年甚至上千年,是不可再生的重要自然资源,是活的化石,在科学研究中具有极其重要的地位。目前古树寿命分子调控机理的研究极少,这是由于古树的分布区域差异大、受环境的破坏以及实验材料不容易获得等原因。树木的维管形成层(vascular cambium)具有不断分裂分化的能力,又被称为“形成层干细胞”,在古树的生长过程中,通过不断的分裂分化维持树木的继续生长与增粗,不仅能准确反应古树的树龄,且因其位置及材质的稳定性使得取材方便。银杏(Ginkgo biloba L.)是现存最古老的裸子植物之一,在中国分布许多百年以上甚至千年的古银杏。本研究利用第二代高通量测序技术对雌株银杏不同树龄维管形成层进行转录组测序分析,并结合细胞学、分子生物学和生物信息学等实验技术对银杏主干维管形成层进行研究,其主要研究结果如下:1.对不同树龄银杏树生长情况、叶片、结实以及种子萌发情况进行了评估和测定工作。发现树龄分别为20年,200年和600年左右的银杏树上没有明显的机械损伤,病虫害等现象。三组树龄银杏树结实正常,并且种子萌发率正常。2.利用半薄切片技术,对包含有韧皮部、形成层和木质部的包埋样品进行切片观察,发现树龄为20年的银杏形成层细胞层数有7至9层,而古树组200年和600年的银杏维管形成层细胞层数明显减少。3.通过Illumina HiSeqTM 2500测序平台对三组不同树龄银杏形成层进行转录组测序,共获得三组样品 Clean read 分别为 54,580,856(52,070,908),55,414,956(53,212,132),54,600,518(52,615,596)条,Q20%在98%之上。之后,通过Trinity软件组装,共获得97,303条 unigenes,平均长度为 1500bp,N50 为 2,476bp。4.将97,303条序列通过BLASTx比对,发现共有63,912条unigenes被注释在6大数据库。其中,在NR数据库中注释到62,266条,占到总unigenes数量的63.99%。此外,COG功能注释发现有25类群,其中转录本、信号传导机制、细胞周期调控和细胞分裂功能类群较多。5.经差异基因表达筛选,我们发现20年与200年间差异基因有2,572条,20年与600年间差异基因有1,312条,以及200年与600年间差异基因有891条。通过与20年相比,古树组差异基因都明显GO富集在细胞成分的胞外区,分子功能下的氧化还原酶活性,以及生物学过程中的次生细胞壁生物合成和木质素代谢过程。此外,通过KEGG富集发现,20年与200年,20年与600年以及200年与600年之间的差异基因KO富集的前两个通路都是代谢通路和次生代谢合成。6.在形成层区域其自身细胞分裂能力对于维管组织的生长是非常重要。因而,我们对被注释为细胞分裂以及扩增相关基因进行分析,发现有21个候选基因,在20年中高表达,而在古树200年和600年中低表达。此外,我们也发现与细胞壁生物合成相关的基因在20年中高表达,而在古树中表达量下降。7.我们对被注释在植物激素信号转导中基因分析,发现有大量基因是响应生长素,赤霉素,细胞分裂素,脱落酸,乙烯和油菜素内酯,并且它们在不同树龄间有着不同的表达模式。其中被注释与生长素和细胞分裂素相关的基因高表在20年树龄中,而低表达在古树组中。而脱落酸受体PYR/PYL基因以及乙烯生物合成相关基因在古树组高表达而低表达在20年银杏形成层中。8.在银杏维管形成层中预测到2,814个转录因子,分属于59个转录因子家族。其中MYB(12.40%),AP2-EREBP(8.02%)和 MYB-related(7.74%)转录因子家族成员最多。此外,通过RPKM>0.3值筛选转录因子,发现每个转录因子家族基因分布在20年、200年和600年都在30%左右。此外,我们进一步研究了差异转录因子在三组不同树龄银杏维管形成层中表达情况,如注释为GAMYB,MADS,bHLH,TCP和zinc transporter 2-like等转录因子。其中与20年对比,总体上古树组200年和600年更多是呈下降趋势。9.应用实时荧光定量PCR方法验证与细胞分裂分化、细胞壁生物合成以及植物激素等差异基因。结果发现RNA-Seq和qRT-PCR表达趋势上一致并且其差异倍数一致性也较好,表明高通量测序结果是可靠的。这些结果进一步阐明与细胞分裂分化,细胞壁生物合成以及植物激素相关基因在不同树龄的银杏维管形成层中的表达量是不同的。综上所述,本研究通过RNA-Seq结合细胞学,分子生物学和生物信息学等技术研究银杏不同树龄维管形成层,这为阐释不同树龄的维管形成层活动的分子机制提供科学理论依据。