干细胞(stem cell)是一种具有多向分化潜能和自我复制功能的未分化细胞，在特定的条件下，可以分化为不同的功能细胞，形成多种组织和器官。胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)的分化和增殖构成个体发育的基础；而成体干细胞(adult stem cell，AS)的进一步分化则是成体组织、器官修复再生的基础。研究干细胞一方面可以揭示许多有关生长发育的基础理论难题，另一方面则可用于临床治疗—细胞移植治疗各种疾病和构建人工组织或器官。体外定向分化是干细胞研究和应用的关键，也是生命科学领域的世界性难题。 起源于颅神经嵴的面突外胚间充质干细胞(ecto-mesenchymal stem cell，EMSC)是胚胎颌面发育过程中的暂时性结构，具有向多种细胞分化的潜能，可以分化为成骨细胞、成软骨细胞、牙乳头细胞、雪旺氏细胞、听神经节等，并将形成上下颌骨、颞下颌关节软骨、牙本质、牙骨质、牙周膜等组织器官，是多能干细胞。作为颌面部多种组织的前体细胞，外胚间充质干细胞在颌面部发育和分化研究中占有重要的地位，并可为组织工程提供可靠的细胞来源，为临床应用奠定坚实的基础。 目前，对外胚间充质干细胞的前体细胞—颅神经嵴细胞进行了定向诱导分化。初步认为，GGF、TGFβs、BMPs等生长因子在体外可影响神经嵴细胞的最终分化。其中BMP-2／4可诱导其分化为神经元，GGF可诱导其分化为雪旺细胞，TGF-β1、2、3可诱导其分化为平滑肌细胞。因此，在体外用各种生长因子进行诱导，外胚间充质干细胞是有可能分化为颌面部发育所需的大部分细胞的。 正常体细胞经过有限的分裂后，会出现衰老、死亡。而永生化细胞具有无限增殖能力。人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)是目前最安全、可靠的永生化基因。利用hTERT永生化面突外胚间充质干细胞，可 第四军医大学博土学位论文以克服有限的细胞来源，为基础研究和应用研究提供充足、可靠的细胞来源。 本实验旨在探讨人早期胚胎面突外胚间充质干细胞的多向分化潜能，并对该细胞永生化进行了初步研究，主要研究内容及结果如下：一、胚胎面突外胚间充质干细胞的培养及鉴定 50天流产自愿捐赠的胚胎，酶消化法培养面突外胚间充质干细胞，白血病抑制因子抑制分化。免疫细胞化学法染色显示，细胞表达迁移中神经峭细胞特异的HNK－l；Vmentin强阳性表达，显示其间充质特性；Vlll因于弱表达；细胞不表达NF、GFAP、a．SMA、CK。结果表明，所获得的细胞为未分化的外胚间充质干细胞，为进一步研究其分化特性奠定了基础。二、外胚间充质干细胞的自发分化 自发分化包括体内及体外研究。 将培养的未分化外胚间充质干细胞注入裸鼠皮下，l 周时部分细胞出现坏死吸收，2周时无法找到注射的细胞，不排除细胞局部同化现象。 在体外，去除白血病抑制因子后2天，外胚间充质干细胞出现明显向平滑肌细胞分化的现象，约的％的细胞表达平滑肌细胞特异性标志a－SMA。二周，约有1％的细胞表达神经纤维细丝蛋白 NF，零星细胞表达神经胶质纤维酸性蛋白GFAP，同时细胞表达1型胶原。表明外胚间充质干细胞有分化能力，自发分化呈现向平滑肌细胞优势分化的倾向。三、外胚间充质干细胞向平滑肌细胞、成骨细胞的诱导分化 利用生长因子法诱导外胚间充质干细胞在体外分化。 免疫细胞化学法图象分析及半定量PCR显示，TGF－日能有效促进EMSC向平滑肌细胞分化，平滑肌细胞比例由自发分化的65％增加到近95％。 在含p－甘油磷酸钠、维生素乙地塞米松的矿化液中，EMSC被诱导分化为成骨细胞，碱性磷酸酶活性增强，I型胶原染色阳性，能形成矿化结节，细胞表达成骨细胞特异的骨钙素。 －4－ 第四军医大学博士学位论文四、外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞的诱导分化 在转化生长因于pl 和牙本质非胶原蛋白的作用下，细胞在胶原三维培养体系中呈现成牙本质细胞特异的形态改变，细胞出现极化，胞核位于一侧，另一侧有很长的突起，细胞平行排列；表达牙本质特异的涎磷蛋白（DSPP）；在矿化液中，诱导细胞能形成矿化结节；在体内，含细胞的胶原也出现矿化趋势。表明EMSC 己被成功诱导分化为终末期的成牙本质样细胞。 诱导分化实验表明，外胚间充质干细胞具有多向分化潜能，在体外能被诱导分化为多种有功能的终末分化细胞。五、外胚间充质干细胞的永生化 采用脂质体转染法，将编码hTERT和 neo基因的真核表达载体PCIneo山TERT导入外胚间充质干细胞。＊418加压筛选后，获3个抗性克隆。免疫细胞化学法检测显示，细胞hTERT活性得以重建，衰老现象得以逆转。增殖能力变强。克隆2来源的细胞在体外长期培养生长良好，至今己 5个月、49代，越过 MI期，命名为（hTERTEMSC－2）。该细胞核型正常、在软琼脂内不能生长、无裸鼠致瘤性。表明转染的细胞是hTERT介导的永生化细胞，?