脊髓白介素-1β在大鼠炎症痛及电针镇痛中的作用及其机制研究炎症痛是最常见的病理性疼痛之一，是由多种原因（包括创伤、细菌、病毒感染以及外科手术）导致外周组织受损所引起的持续性的疼痛状态。关于炎症痛产生的外周和中枢机制一直是近年国内外疼痛研究的热点。国内外大量研究表明，许多外周和中枢结构以及多种化学物质参与了炎症痛的形成及调制过程。然而，目前对其确切的发病机制尚未完全明确。临床上用抗炎镇痛药物来控制慢性炎症痛的效果也不很理想，长期使用还会有众所周知的副作用。所以，炎症痛的治疗一直是临床上的一大难题。而在这方面，针刺疗法和针刺研究是大有可为的。针刺是一种有效而副作用极少的治疗炎症痛的手段，经国内外大量临床实践已经证实其对急性痛和慢性痛都有镇痛作用。特别是在近期，针刺镇痛的临床疗效经过国外现代医学方法的考察，证实其具有安全、有效、副作用少、生理干扰小的特点。但由于炎症痛机制的复杂性，针刺抗炎症痛的机制目前还尚未完全明确。白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）是一种重要的炎性细胞因子，可作用于机体的各个系统，具有广泛的生物学活性。白介素-1受体（Interleukin-1 receptor，IL-1R）有两种形式：Ⅰ型受体（IL-1RⅠ）和Ⅱ型受体（IL-1RⅡ）。白介素-1β主要通过与IL-1RⅠ结合而发挥作用。大量研究表明，IL-1β在中枢神经系统中参与痛觉调制，但是对于它究竟起镇痛还是痛敏的作用却报道不一。有人认为IL-1在不同部位的镇痛或痛敏的不同作用是通过不同的途径抑制或兴奋下行痛觉调制系统的作用的结果。这提示了中枢神经系统中的IL-1β在痛觉调制中的作用有待进一步研究。因此，阐明脊髓内源性IL-1β对炎症痛和电针镇痛的影响是本课题研究的主要内容之一。蛋白激酶D（protein kinase D，PKD）是一种新型丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。研究表明，PKD可直接磷酸化辣椒素受体（VR1），并增强VR1的功能。而VR1是痛觉信息的整合器，在介导炎性痛敏中发挥着重要作用，提示PKD可能在炎性痛敏的发生和维持中也发挥着重要作用。IL-1β可以通过激活蛋白激酶C（PKC）发挥作用，而PKD也大多由PKC激活。那么PKD是否参与了IL-1β的痛觉信号通路呢?作为信号通路的下游分子，p38及核因子κB（NF-κB）可被IL-1β激活，并调控痛觉相关物质（如IL-6、TNF-α、COX-2等）的基因表达，在痛觉调制中发挥着重要作用。那么，IL-1β对它们的调控与PKD之间又是否存在着密切联系呢?因此，探讨IL-1β痛觉信号通路中PKD的作用及PKD的上、下游信号分子，以揭示IL-1β在炎症痛中的作用机制，也是本课题研究的另一主要内容。综上所述，本课题拟在角叉菜胶建立的大鼠单侧足底炎症痛模型上，从整体到离体等不同水平，采用行为学、RT-PCR、Western blot、ELISA、免疫化学染色以及神经细胞培养、转染等技术，（1）明确电针对炎症痛大鼠痛阈及脊髓IL-1β、IL-1RⅠ表达的影响；（2）观察应用反义寡核苷酸技术下调IL-1RⅠ表达对大鼠炎症痛及电针镇痛的影响；（3）研究炎症痛及电针镇痛时PKD在IL-1β痛觉信号通路中的作用；（4）研究脊髓神经元中PKC及p38、NF-κB在IL-1β／PKD信号通路中的作用。实验结果如下：1．电针对炎症痛大鼠痛阈及脊髓IL-1β、IL-1RⅠ表达的影响1．1角叉菜胶注射引起的炎性痛敏反应大鼠左侧足掌注射2％角叉菜胶100μl，分别于注射前及注射后105至300min内，测量注射爪及未注射爪的缩爪潜伏期（PWL）。结果表明，角叉菜胶可显著降低大鼠痛阈，诱发明显的热痛敏。1．2电针对炎症痛大鼠痛阈的影响大鼠随机分成4组：正常组（Normal）、角叉菜胶组（Carrageenan）、角叉菜胶+电针组（Carrageenan+EA）、角叉菜胶+假电针组（Carrageenan+sham EA）。电针组于角叉菜胶注射3h后给予电针治疗30min。分别于角叉菜胶注射前及注射后180至300min内，测量大鼠PWL。结果表明，电针可明显提高炎症痛大鼠痛阈，具有显著的镇痛效应，而假电针对炎症痛大鼠痛阈无影响。1．3电针对炎症痛大鼠脊髓IL-1β表达的影响实验分组同上。电针组于角叉菜胶注射3h后给予电针治疗30min。采用ELISA技术，分析IL-1β含量变化。结果表明，炎症痛时脊髓IL-1β表达增加，电针可使其降低，而假电针无明显作用。1．4电针对炎症痛大鼠脊髓IL-1RⅠ表达的影响实验分组同上。电针组于角叉菜胶注射3h后给予电针治疗30min。分别采用RT-PCR及Western blot方法分析IL-1RⅠmRNA及蛋白表达变化。结果表明，炎症痛时脊髓IL-1RⅠmRNA及蛋白表达增加，电针可使其降低，而假电针无明显作用。小结：大鼠足掌注射角叉菜胶可诱发炎症痛；电针对炎症痛大鼠有显著镇痛作用；炎症痛时大鼠脊髓IL-1β及IL-1RⅠ表达明显增加；电针可降低炎症痛诱导的IL-1β及IL-1RⅠ表达。以上结果提示，脊髓内源性IL-1β及IL-1RⅠ参与了角叉菜胶诱导的炎症痛，且电针可能通过降低脊髓IL-1β及IL-1RⅠ表达发挥其镇痛作用。2．应用反义寡核苷酸技术下调IL-1RⅠ表达对大鼠炎症痛及电针镇痛的影响2．1鞘内注射IL-1RⅠ的反义寡核苷酸对脊髓IL-1RⅠ表达的影响大鼠随机分为3组，各组大鼠行鞘内插管后，分别给予针对IL-1RⅠ的反义寡核苷酸（Antisense组）、正义寡核苷酸（Sense组）以及生理盐水（NS组）。给药剂量：每只大鼠每次给予50μg寡核苷酸，每天给药一次。连续给药3天后分别采用RT-PCR及Western blot技术检测IL-1RⅠmRNA及蛋白的表达变化。结果表明，鞘内注射IL-1RⅠ的反义寡核苷酸可明显下调脊髓IL-1RⅠmRNA及蛋白表达。2．2鞘内注射IL-1RⅠ的反义寡核苷酸及与电针合用对脊髓IL-1β表达的影响大鼠随机分为5组，各组大鼠行鞘内插管后，分别给予针对IL-1RⅠ的反义寡核苷酸（antisense组）及生理盐水（NS组）。给药剂量同前，每天给药一次，连续给药3天。第3天给药后于左侧足掌注射2％角叉菜胶。电针组于角叉菜胶注射3h后给予电针治疗30min。采用ELISA技术，分析IL-1β含量变化。结果表明，鞘内注射IL-1RⅠ的反义寡核苷酸对脊髓IL-1β表达无显著影响，反义寡核苷酸与电针合用并未进一步降低脊髓IL-1β表达。2．3鞘内注射IL-1RⅠ的反义寡核苷酸对正常大鼠痛阈的影响大鼠随机分为3组，各组大鼠行鞘内插管后，分别给予针对IL-1RⅠ的反义寡核苷酸（Antisense组）、正义寡核苷酸（Sense组）以及生理盐水（NS组）。给药剂量同前，每天给药一次，连续给药3天。每天给药后测量大鼠PWL。结果表明，下调脊髓IL-1RⅠ表达对正常大鼠痛阈无显著影响。2．4鞘内注射IL-1RⅠ的反义寡核苷酸对炎症痛大鼠痛阈的影响实验分组同上。给药剂量同前，每天给药一次，连续给药3天。第3天给药后于左侧足掌注射2％角叉菜胶。分别于角叉菜胶注射前及注射后105至300min内测量PWL。结果表明，下调脊髓IL-1RⅠ表达可明显提高炎症痛大鼠痛阈。2．5 IL-1RⅠ的反义寡核苷酸与电针合用对炎症痛大鼠痛阈的影响大鼠随机分为4组：反义寡核苷酸+电针组（Antisense+EA）、反义寡核苷酸组（Antisense）、生理盐水+电针组（NS+EA）以及正义寡核苷酸+电针组（Sense+EA）。分别给予IL-1RⅠ的反义寡核苷酸、正义寡核苷酸以及生理盐水，给药剂量同前，每天给药一次，连续给药3天。第3天给药后于左侧足掌注射2％角叉菜胶。电针组于角叉菜胶注射3h后给予电针治疗30min。分别于角叉菜胶注射前及注射后180至300min内测量PWL。结果显示，Antisense+EA组大鼠的PWL比其他三组均明显较高，而NS+EA组和Sense+EA组之间没有显著差异。表明下调IL-1RⅠ的表达可增强电针的镇痛作用。小结：鞘内注射IL-1RⅠ的反义寡核苷酸明显下调脊髓IL-1RⅠ表达，但对IL-1β表达无明显影响；下调脊髓IL-1RⅠ表达对正常大鼠痛阈无显著影响，但能明显提高炎症痛大鼠痛阈；IL-1RⅠ的反义寡核苷酸与电针合用进一步提高炎症痛大鼠痛阈。以上结果提示，脊髓内源性IL-1β通过IL-1RⅠ促进了炎症痛的发生、发展，并在电针镇痛过程中起到了拮抗作用。3．炎症痛及电针镇痛时PKD在IL-1β痛觉信号通路中的作用3．1角叉菜胶及电针对脊髓PKD表达及活性的影响大鼠随机分为4组：正常组（Normal）、角叉菜胶组（Carrageenan）、角叉菜胶+电针组（Carrageenan+EA）及角叉菜胶+假电针组（Carrageenan+sham EA）。电针组于角叉菜胶注射3h后给予电针治疗30min。采用Western blot方法分析PKD表达及活性变化。结果表明，角叉菜胶注射后脊髓中磷酸化PKD表达增加，电针可使其降低，而非磷酸化PKD呈稳定表达，炎症及电针均不能影响其表达。3．2脂多糖（LPS）对原代培养脊髓神经元中IL-1β表达的影响为进一步研究PKD在IL-1β痛觉信号通路中的作用，本课题应用了离体脊髓神经元原代培养技术。胎鼠脊髓神经元原代培养10天，进行免疫荧光鉴定，显示神经元生长状况良好，密度适中。在原代培养10天的神经元培养液中，加入LPS（30μg／ml）分别刺激0.5、1、3、8、12h后，分析脊髓神经元中IL-1β表达的变化。结果显示，LPS可以时程依赖性地诱导IL-1β表达，0.5h内即有出现，8h时达到最高，12h时开始下降。表明LPS刺激可以模拟细胞炎性环境，诱导IL-1β表达增加。3．3 LPS对原代培养脊髓神经元中PKD表达及活性的影响在原代培养10天的神经元培养液中，加入LPS分别刺激0.5、1、3、8、12h后，分析脊髓神经元中PKD表达及活性变化。结果显示，LPS可以时程依赖性地诱导PKD磷酸化，0.5h内即有出现，8h时达到最高，12h时开始下降，与IL-1β的时程性表达一致。而非磷酸化PKD在脊髓神经元中呈稳定表达，LPS刺激不能影响其表达。以上结果提示，PKD可能与IL-1β痛觉信号通路存在密切联系。3．4白介素-1受体拮抗剂（IL-1Ra）对LPS诱导PKD活化的影响在原代培养10天的神经元培养液中，加入LPS及不同剂量的IL-1Ra（50-1000nM）共同孵育8h，分析脊髓神经元中PKD活性及表达的变化。结果显示，IL-1Ra可剂量依赖性地抑制LPS诱导的PKD磷酸化，50nM即有明显作用，1000nM作用达到最大。而PKD表达没有明显变化。提示IL-1β在PKD磷酸化过程中起到了重要作用。小结：正常大鼠脊髓中存在少量的PKD磷酸化，炎症痛时PKD活性升高，电针可使其降低；原代培养的大鼠脊髓神经元中，LPS可时程依赖性地诱导IL-1β及磷酸化PKD表达；IL-1Ra可剂量依赖性地抑制LPS诱导的PKD磷酸化。以上结果提示，炎症痛时IL-1β可能通过激活PKD参与痛觉调制。4．PKC及p38、NF-κB在IL-1β／PKD信号通路中的作用4．1 LPS对原代培养脊髓神经元中PKC活性的影响在原代培养10天的神经元培养液中，加入LPS分别刺激0.5、1、3、8、12h后，分析脊髓神经元中PKC活性的变化。选用特异性抗体分别检测p-PKC（pan）、p-PKCα／β_Ⅱ、p-PKCγ、p-PKCδ及p-PKCζ／λ。结果显示，LPS可以时程依赖性地诱导以上各亚型PKC发生磷酸化，0.5h内即有出现，3或8h时达到最高，12h时开始下降。4．2 IL-1Ra对LPS诱导PKC活化的影响在原代培养10天的神经元培养液中，加入LPS及不同剂量的IL-1Ra（50-1000nM）共同孵育8h，提取细胞蛋白，分析脊髓神经元中PKC活性的变化。结果显示，IL-1Ra可剂量依赖性地抑制LPS诱导的PKC（pan）及PKCα／β_Ⅱ磷酸化，50nM即有明显作用，1000nM作用达到最大。而其他亚型PKC的活性没有明显变化。提示IL-1β在PKCα／β_Ⅱ磷酸化过程中起到了重要作用。4．3 PKC抑制剂对LPS诱导PKD活化的影响为明确PKD是否由PKC激活，在原代培养10天的神经元培养液中，加入LPS刺激7h后，再加入Ro-32-0432（一种选择性PKC抑制剂，主要针对PKCα和PKCβ，100nM）孵育1h。对照组给予同样剂量的DMSO（Me₂SO，Ro-32-0432的溶剂）孵育1h。结果显示，与对照组比较，Ro-32-0432几乎完全抑制了LPS诱导的PKD磷酸化。表明PKC（尤其是PKCα或PKCβ）参与了LPS诱导的PKD活化。为进一步确定哪种PKC亚型参与了PKD活化，在原代培养10天的神经元培养液中，加入LPS刺激7h后，再加入PKCβ抑制剂[3-（1-（3-Imidazol-1-ylpropyl）-1H-indol-3-yl）-4-anilino-1H-pyrrole-2，5-dione，100nM]孵育1h。对照组给予同样剂量的DMSO孵育1h。结果显示，与对照组比较，PKCβ抑制剂对LPS诱导的PKD磷酸化无明显作用。提示可能主要是PKCα参与了LPS诱导的PKD活化。4．4 LPS对p38及NF-κB表达的影响在原代培养10天的神经元培养液中，加入LPS分别刺激0.5、1、3、8、12h后，分析脊髓神经元中p38及NF-κB表达的变化。结果显示，LPS可以时程依赖性地诱导p38磷酸化及NF-κB表达，0.5h内即有出现，8h时达到最高，12h时开始下降，与IL-1β及PKD的时程性表达变化一致。非磷酸化p38在脊髓神经元中呈稳定表达，LPS刺激不能影响其表达。提示p38和NF-κB可能与IL-1β／PKD通路存在密切联系。4．5 IL-1Ra对LPS诱导的p38活化及NF-κB表达的影响在原代培养10天的神经元培养液中，加入LPS及不同剂量的IL-1Ra（50-1000nM）共同孵育8h，分析脊髓神经元中p38及NF-κB表达的变化。结果显示，IL-1Ra可剂量依赖性地抑制LPS诱导的p38磷酸化及NF-κB表达，50nM即有明显作用，1000nM作用达到最大。非磷酸化p38表达无明显变化。提示IL-1β参与了LPS诱导的p38活化及NF-κB表达。4．6 PKC抑制剂对LPS诱导的p38活化及NF-κB表达的影响为确定PKC是否参与p38活化及NF-κB表达，以及哪种亚型参与其中，在原代培养10天的神经元培养液中，加入LPS刺激7h后，分别加入Ro-32-0432（100nM）及PKCβ抑制剂（100nM）孵育1h。对照组给予同样剂量的DMSO（Me₂SO，Ro-32-0432的溶剂）孵育1h。结果显示，与对照组比较，Ro-32-0432抑制了LPS诱导的p38磷酸化及NF-κB表达，而PKCβ抑制剂无明显作用。提示PKCα参与了LPS诱导的p38活化及NF-κB表达。4．7下调PKD表达对LPS诱导的p38活化及NF-κB表达的影响为确定PKD是否参与p38活化及NF-κB表达，在原代培养8天的神经元培养液中，加入PKD的反义寡核苷酸（antisense，0.2μM）转染细胞，孵育48h。对照组给予同样剂量的载体（vehicle）或正义寡核苷酸（sense）。结果表明，PKD的反义寡核苷酸转染细胞可下调PKD表达。在PKD的antisense、vehicle或sense孵育48h后，再加入LPS刺激8h。结果显示，与对照组比较，antisense组LPS诱导的p38磷酸化及NF-κB表达明显下降。表明PKD参与了LPS诱导的p38活化及NF-κB表达。小结：原代培养脊髓神经元中，LPS可时程依赖性地诱导PKC、p38磷酸化及NF-κB表达；IL-1Ra可剂量依赖性地抑制LPS诱导的PKC（pan）、PKCα／β_Ⅱ、p38磷酸化及NF-κB表达；PKCα参与了LPS诱导的PKD、p38活化及NF-κB表达；下调PKD表达可抑制LPS诱导的p38磷酸化及NF-κB表达。以上结果提示，脊髓神经元中可能存在IL-1β／PKCα／PKD／p38（NF-κB）痛觉信号通路。综上所述，本工作提示：1．炎症痛及电针镇痛时，大鼠脊髓IL-1β及IL-1RⅠ表达发生变化，提示脊髓内源性IL-1β参与了角叉菜胶诱导的炎症痛，电针可能通过降低脊髓IL-1β及IL-1RⅠ表达发挥其镇痛作用。2．下调脊髓IL-1RⅠ表达可提高炎症痛大鼠痛阈，与电针合用可使痛阈进一步提高，提示脊髓内源性IL-1β可通过IL-1RⅠ促进炎症痛的发生、发展，并在电针镇痛过程中起到了拮抗作用。3．大鼠脊髓及原代培养的脊髓神经元中，IL-1β可能通过激活PKD参与痛觉调制。4．脊髓神经元中可能存在IL-1β／PKCα／PKD／p38（NF-κB）痛觉信号通路。