论文部分内容阅读
目的:生物信息学分析吸烟与慢性阻塞性肺疾病（COPD）状态下UCHL1的表达规律,以香烟烟雾及其提取物分别刺激小鼠和BEAS-2B细胞,构建染毒模型,探索UCHL1在香烟烟雾引起的气道上皮损伤过程中的变化、作用以及相关机制。方法:（1）生物信息学分析筛选在GSE5058数据集不吸烟对照组、吸烟组、COPD组中表达递增或递减的基因,在数据集GSE76925中重复验证,选择UCHL1作进一步分析。（2）在GeneCards数据库与GTEx数据库中检索UCHL1在各个组织及器官表达概况以及UCHL1在肺组织各个类型细胞中的表达,利用皮尔森相关性分析筛选在GSE5058数据集不吸烟对照组、吸烟组、COPD组表达递增基因中与UCHL1表达相关性最高的200个基因,并进行GO功能富集分析。（3）建立COPD小鼠模型,SPF级C57BL/6J雄性小鼠,共16只,按每组8只随机分至对照组、吸烟组。对照组小鼠自由呼吸新鲜空气,香烟组小鼠暴露于香烟烟雾中,每次半小时,每天2次,一周5天,连续暴露24周,按时记录各组小鼠体重。收集小鼠肺组织用于HE染色、免疫组化,肺泡灌洗液用于ELISA检测。（4）建立细胞染毒模型:选择BEAS-2B细胞,对照组予完全培养基,CSE组在完全培养基的基础上添加香烟烟雾提取物（CSE）,CSE相对浓度为2%,连续处理8周。Western blot检测CSE处理对UCHL1、GPX1/2、SOD1、Trx、E-cadherin、α-SMA、Vimentin表达的影响,对应试剂盒检测各组细胞ROS、总SOD及总GPX水平,划痕实验观察细胞迁移。（5）慢病毒转染BEAS-2B细胞,建立过表达UCHL1的LV-UCHL1、抑制UCHL1表达的LV-UCHL1-RNAi以及空载对照LV-Control三个稳定转染细胞株,qPCR、Western blot验证转染效力,MTT法检测细胞增殖。按如下分组:LV-Control、LV-UCHL1、LV-UCHL1-RNAi、LV-Control+CSE、LV-UCHL1+CSE、LV-UCHL1-RNAi+CSE,处理8周,以对应试剂盒检测各组细胞内ROS、总SOD及总GPX水平,transwell实验观察细胞迁移。（6）设立UCHL1过表达组:LV-Control、LV-UCHL1、LV-Control+CSE、LV-UCHL1+CSE;UCHL1 抑制组:LV-Control、LV-UCHL1-RNAi、LV-Control+CSE、LV-UCHL1-RNAi+CSE;连续处理8周。Western blot检测两个分组中不同处理条件下细胞内UCHL1、GPX1/2、E-cadherin、α-SMA、Vimentin蛋白表达水平。结果:（1）UCHL1在不吸烟者、吸烟者、COPD患者小气道上皮表达呈递增状态;UCHL1在COPD患者肺组织的表达高于非COPD的吸烟者,且不受年龄和性别的显著影响。（2）UCHL1在正常肺组织中肺泡Ⅰ型上皮、肺泡Ⅱ型上皮、肺泡巨噬细胞、纤毛细胞中均有少量表达。GSE5058数据集不吸烟对照、吸烟者、COPD患者小气道上皮表达递增基因中与UCHL1表达相关性前200名的基因进行了GO功能富集分析,结果主要集中在氧化还原过程与氧化还原酶的活性等方面。（3）小鼠肺组织HE染色:吸烟组小鼠较对照组出现肺泡腔增大、肺泡间隔破坏、肺气肿形成。烟雾暴露使肺泡平均线性截距（MLI）增大（p<0.01）。吸烟组小鼠肺泡灌洗液和肺组织匀浆IL-6显著高于对照组小鼠（p<0.01）。免疫组化结果:吸烟组小鼠肺组织UCHL1、α-SMA表达较对照组增加,而GPX1/2、SOD1、Trx以及E-cadherin表达较对照组减少（p<0.05）。（4）CSE长期处理可致BEAS-2B细胞ROS水平增高,总SOD下降,细胞划痕实验显示BEAS-2B细胞迁移能力增强（p<0.05）。CSE组UCHL1、GPX1/2、α-SMA、Vimentin表达水平较对照组升高,而SOD1、Trx、E-cadherin表达水平较对照组下降（p<0.05）。（5）UCHL1正向调控BEAS-2B细胞增殖（p<0.05）;在都给予CSE处理的情况下,过表达UCHL1使总GPX及总SOD水平较空载体组升高,ROS水平下降;抑制UCHL1表达会使总GPX及总SOD水平下降,ROS水平升高（p<0.05）。Transwell迁移实验表明,过表达UCHL1可以抑制CSE刺激引起的迁移能力增加,而抑制UCHL1表达,使CSE刺激加强的细胞迁移能力进一步增强（p<0.05）。（6）过表达UCHL1提高了CSE刺激下BEAS-2B细胞的GPX1/2水平,而抑制UCHL1表达显著限制了CSE刺激下细胞内GPX1/2表达（p<0.05）。过表达UCHL1抑制了CSE刺激引起的E-cadherin表达下降和α-SMA、Vimentin表达增加,抑制UCHL1表达则加强了CSE刺激引起的E-cadherin表达下降和α-SMA、Vimentin表达增加（p<0.05）。结论:在吸烟诱导COPD的过程中,气道上皮出现氧化应激,炎症因子水平增加,气道上皮细胞发生上皮间质转化,同时伴随着UCHL1表达增高。UCHL1可以负向调控CSE刺激下BEAS-2B细胞的ROS水平,可能是UCHL1正向调控GPX1/2表达影响了支气管上皮细胞抗氧化能力,同时UCHL1也能调节CSE刺激下支气管上皮细胞的上皮间质转化,UCHL1具有成为COPD诊断分子标志物和治疗靶点的潜力。