MicroRNA和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）等生物标志物的准确测定为疾病诊断及预后评估提供了有力的工具,然而复杂基质生物样品中这些标志物通常含量极低。为提高灵敏度,当前microRNA等核酸标志物及核酸工具酶活性检测方法通常会依赖各种信号扩增机制。基于恒温扩增原理的末端延伸扩增机制,主要包括滚环扩增（RCA）和TdT延伸机制等,因其信号输出稳定、设计灵活、操作简便等特点受到广泛关注,已成为多种生物标志物检测的重要手段。然而,传统的基于末端延伸的扩增策略多是线性扩增机制,扩增效率和检测灵敏度受到较大限制。针对上述问题,本论文设计了一系列基于末端延伸的信号扩增新策略,显著提升了信号扩增效率和检测灵敏度,实现了单细胞乃至单分子水平microRNA和TdT酶活性分析。（1）通过将RCA的独特优势和环介导等温扩增反应（LAMP）相结合,建立了一种超灵敏的RCA-LAMP策略用于检测microRNA。该设计中,microRNA作为连接锁式探针的模板,将引发RCA末端延伸反应并产生长的重复序列。合理设计的反向茎环结构引物（SLP）能够肩并肩地和该重复序列杂交,引发级联的延伸和顶替反应,产生大量双哑铃结构DNA,作为起始物质可引发后续高效的LAMP扩增。与传统的基于RCA的核酸分析方法相比,RCA每个延伸产物可生成若干双茎环DNA,将分别独立引发指数LAMP扩增,在没有引入额外实验操作步骤的情况下（RCA和LAMP一步进行,无需额外的样品转移步骤）,扩增效率和灵敏度获得了显著提升,可检测低至10 aM的microRNA。（2）受上述高效RCA-LAMP方法启发,本文进一步将TdT的DNA末端延伸功能和LAMP扩增相结合建立了一种超灵敏检测TdT活性的TEA-LAMP扩增新策略。创新设计了 3’-OH的茎环引物（SLP-A）,只有在TdT存在下发生末端延伸,生成长的poly（T）单链DNA。带有3’-A（20）粘性末端的另一种茎环引物（SLP-B）将与poly（T）依次杂交并发生级联的反向延伸及顶替反应。这样,每个TdT延伸产物均能产生大量双茎环结构的LAMP起始DNA结构,分别独立引发后续高效LAMP扩增,实现了 TdT活性的超高灵敏度检测。该策略可以检测到低至2×10-8 U/μL的TdT,是目前已有报道TdT检测方法中灵敏度最高的方法。由于TEA-LAMP 具有超高灵敏度,该方法也成功实现了单细胞中 TdT 活性的准确定量,这对于在单细胞水平上揭示TdT表达异质性与细胞命运及重大疾病进化之间的关系具有重要意义。此外,通过使用TdT作为辅因子,该TEA-LAMP方法可以扩展到其他核酸工具酶检测。（3）论文第四章,通过引入一对引物,设计了 microRNA引发的超支化RCA扩增体系,通过与T7转录扩增及基于CRISPR-Cas12a的信号放大体系相结合,发展了基于三重信号扩增策略（Cas-TCA）的microRNA分析新方法。超支化引物的加入使得原料得以高效利用,提高了 RCA扩增效率,形成大量长度不一的含有T7转录识别位点的双链DNA,引发多位点转录扩增反应,产生大量pre-crRNA序列。Pre-crRNA进一步被Cas12a修剪,产生成熟的crRNA。它能够和Cas12a组装在一起以识别双链DNA激活序列并激活其并行的反式切割活性,高效地水解荧光团/猝灭团双标记的单链DNA报告分子,产生显著增强的荧光信号。与传统需要预合成及纯化步骤才能获得crRNA的CRISPR-Cas传感体系不同,该方法中,通过目标物microRNA响应产生pre-crRNA并进一步被CRISPR-Cas12a修剪/募集,无需额外的crRNA合成及纯化步骤。该方法扩展了 CRISPR-Cas体系的传感应用范围,在基于CRISPR-Cas的生物学和生物医学研究领域具有良好应用前景。（4）Cas-TCA体系过程包括连接、延伸及转录多个步骤,限制了该方法在快速现场检测领域的应用。为解决该问题,我们尝试将以上三步反应整合成一步,期望实现简单、高效的一步扩增策略。然而,由于各种酶反应缓冲液复杂的构成,这三步扩增体系不能兼容。但我们发现在恒温条件下,连接反应和T7转录反应可一步完成。基于该发现,我们建立了基于连接转录一步扩增机制检测microRNA的策略。该策略中使用的锁式探针、SplintR连接酶、T7 RNA聚合酶及反应缓冲液都同时加入。当靶标microRNA存在时,SplintR连接酶介导锁式探针连接反应的发生。随后,T7RNA聚合酶以环形探针为模板,引发转录扩增（RCT）。此外,转录产物包含目标物序列,又可作为反应液中未连接探针的模板。这种反复扩增的机制能够产生大量pre-crRNA序列。最后,基于CRISPR-Cas12a检测系统实现了 microRNA的灵敏检测。