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小麦是我国的第二人粮食作物,土壤的盐渍化严重制约着小麦的生产,提高小麦的抗盐性是小麦的重要育种目标之一。运用分子生物学手段,通过耐盐相关基因作图和克隆,不公为小麦耐盐分子机制提供理论依据,而且为最终实现转基因耐盐小麦奠定了基础。本研究通过QTL分析,抗盐相关基因的同源序列克隆及功能验证取得了以下结果: 1.本实验采用Opata85×W7984 RIL群体及已构建的遗传连锁图,用芽期耐盐指数,胚根鲜重、干重,胚芽鲜重、干重,苗期盐害指数,植株干重、鲜重,根冠比,叶片脯氨酸含量,叶片叶绿素含量等多个耐盐相关生理指标,采用QTLmapper1.0软件对耐盐相关性状进行了QTL定位。共定位到69个QTLs,其中芽期22个,苗期47个。在3A染色体xglk683-xcd0460间,3B染色体xfbbl68-xbcd147间,4D染色体xcko1081-xfbb226间和6D染色体xpsr106-xfbb283间是多个性状的QTL共同指向的区段,可能是主效QTL位点。其中4D染色体上xcko1081-xfbb226间是控制芽期耐盐性的QTL位点,6D染色体xpsr106-xfbb283间是控制苗期耐盐性的QTL位点,3A染色体xglk683-xcd0460间和3B染色体xfbb168-xbcd147间是同时控制曲期和芽期的QTL位点。这些QTL位点为分子标记辅助育种和耐盐QTL的图位克隆提供了帮助。 2.吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因是脯氨酸生物合成的限速酶,本研究以耐盐的小国小麦地方品种茶淀红为试材,采用同源序列克隆方法,得到了小麦TaP5CS基因,其cDNAK度为2260bp,包含2151bp的ORF,编码717个氨基酸,含有ATP、NADPH结合位点和谷氨酸激酶、谷氨酸脱氢酶保守域,脯氨酸反馈抑制作用位点。该基因在GenBank的登陆号为AY888045。在基因组DNA上获得了7400bp的片段,约含有18个内含子,19个外显子。Southern杂交的结果表明,TaP5CS基困在小麦基因组中有2个拷贝,定位在小麦的第二部分同源群上。Northern杂交和半定量RT-PCR的结果表明,小麦TaP5CS基因是受盐胁迫诱导上调表达的基因,在盐胁迫下有2个转录高峰。将该基因转入拟南芥中,Northern blotting的结果表明在正常情况下,小麦TaPSCS基因在拟南芥中能够正常表达,在盐、PEG、ABA胁迫下,TaP5CS基因的转录本进一步积累。并且在低度和中度盐胁迫下,能促进根的伸长,根的生物量增加,提高脯氨酸的含量、可溶性蛋白含量、叶绿素的含量、促进植株的生长,提高植株地上部分的生物量。而TaP5CS基因在拟南芥中的反义表达,抑制了拟南芥AtP5CS基因的活力,降低了脯氨酸的合成积累,降低根的伸长速率。反义表达的拟南芥植株开花结实率低,果荚变小,种子数少,但种子变大。反义表达短片段P5CS262的作用要大于反义表达长片段P5CS-2151。 3.以同源序列克隆的方法在cDNA利基因组DNA水平上,获得了小麦吡咯啉-5-羧酸还原酶(TaP5CR)基因,TaP5CR1基因cDNA全长1025bp,基阅组DNA为2600bp,包含7个外显子和6个内含子,编码288个氨基酸的多肽,GenBank登陆号为AY880317。Southern杂交的结果表明,该基因有2个以上的拷贝。不同六倍体小麦的等位变异分析表明该基因是很保守的。Northern blot分