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背景肝癌（liver cancer）作为一种常见的上消化道恶性肿瘤,是造成全球公共卫生问题的主要原因之一。中国是全球肝癌的高发区之一,以肝细胞癌（hepatocellular caricinoma,HCC）为主。HCC多起病隐匿,且目前尚无有效的早期诊断方法,因此,多数HCC患者确诊时已是中晚期,从而导致肝细胞癌患者的预后较差。因此,寻找可用于肝细胞癌的非侵入性早期诊断方法,具有重要的临床意义和公共卫生价值。研究证实,部分抗肿瘤相关抗原（tumor associated antigen,TAA）的自身抗体（antoantibodies to TAAs,TAAbs）在正常人的血清中低表达甚至不表达,而在肿瘤患者血清中其水平的升高可早于肿瘤症状的出现且可持续稳定存在,因此,这部分TAAbs具有成为HCC诊断标志物的潜力,提示其TAA可能在HCC的发生发展中发挥重要作用。目的利用人类蛋白质组芯片技术筛选肝细胞癌相关的候选TAAbs,在此基础上评价其诊断HCC的价值,基于建立的多种HCC的诊断模型筛选出最优模型,进一步探索代表性抗PAIP1自身抗体的TAA PAIP1在肝癌细胞的发生发展中的生物学功能,最终为HCC非侵入性诊断方法的建立提供理论资料和科学依据。方法1.人类蛋白质组芯片技术筛选HCC相关的候选TAAbs基于人类蛋白质组芯片技术,以HCC患者和健康对照血清进行筛选,利用Mann-Whitney U检验、设置合适的阈值在病例组和对照组计算阳性率等多种不同的分析方法和条件,筛选出肝细胞癌组显著高于健康对照组的候选TAAbs。2.多阶段大样本验证及评价候选TAAbs对HCC的诊断价值1)本研究应用间接酶联免疫吸附实验（ELISA）技术完成HCC相关的候选TAAbs的四阶段验证。第一阶段为初步测试阶段,检测测试组（HCC和健康对照各96例）血清;第二阶段为验证阶段,检测训练组（HCC和健康对照各195例）血清;第三阶段为确认阶段,检测验证组（160例HCC、160例健康对照、96例慢性乙肝和157例肝硬化）血清,第四阶段为特异性验证阶段,检测特异性验证组（80例胃癌、120例食管鳞癌和120例健康对照）血清。2)通过Mann-Whitney U检验分析TAAbs在肿瘤组和健康对照组血清中的差异表达情况,绘制训练组和验证组的TAAbs诊断HCC的ROC曲线并评价其价值。3)绘制箱式图,观察TAAbs在健康对照组、慢性乙肝组、肝硬化组、不同分期HCC亚组的人群血清中表达水平的变化趋势。3.HCC诊断模型的构建及评价1)模型的构建和验证:多阶段验证结果中,HCC组中的表达水平显著高于健康对照组的TAAbs用于模型的构建及外部验证。利用第二阶段（训练组）数据构建Logistic回归模型、经典决策树模型、支持向量机模型和并联诊断试验四种HCC的诊断模型,利用第三阶段（验证组）数据对构建的模型进行外部验证。基于筛检试验的评价体系评价各模型的诊断价值及稳定性,筛选出最优模型。2)最优模型的亚组分析:绘制最优模型诊断各临床亚组（不同分期、不同甲胎蛋白水平、是否小肝癌、是否合并慢性乙肝等）HCC患者的ROC曲线,并评价其价值。4.PAIP1表达对肝癌细胞的生物学功能的影响综合分析以上验证结果,发现抗PAIP1自身抗体在多阶段验证中呈现出稳定较大的诊断HCC的价值,提示其相应的TAA PAIP1较大可能参与HCC的发生发展过程,因此,本研究进一步探索PAIP1的表达对肝癌细胞的生物学功能的影响。1)GEPIA数据库分析PAIP1在HCC患者的癌组织和正常肝组织中的m RNA表达水平,免疫组化方法检测PAIP1在HCC患者的癌和癌旁组织中的蛋白表达水平。2)体外细胞实验:实时荧光定量PCR（q RT-PCR）和蛋白质免疫印迹法（Western blot,WB）分析PAIP1在人正常肝细胞株（L02）及人肝癌细胞株（SMMC7721、Hep G2、Huh7、Hep3b和SNU449）中的m RNA和蛋白质的表达情况;构建PAIP1干扰慢病毒转染SMMC7721和Hep G2细胞株,通过Transwell迁移和侵袭实验、CCK8实验检测PAIP1下调对肝癌细胞迁移、侵袭和增殖能力的影响。结果1.利用人类蛋白质组芯片技术发现15种HCC相关的候选TAAbs,即抗RUNX1T1、RAD23A、CAST、PRKCZ、SF3B3、SARS、DUSP6、PAIP1、SH2B1、NAP1L4、CRLF3、LARP6、NOL7、MAGEA12和CCDC6自身抗体。2.第一阶段验证结果显示:15种TAAbs中的9种（抗RUNX1T1、RAD23A、CAST、PRKCZ、SF3B3、SARS、DUSP6、PAIP1和CRLF3自身抗体）在HCC组血清中的表达水平显著高于健康对照组（P＜0.05）。3.第二和第三阶段验证结果显示:在训练组血清中,9种TAAbs中的8种（抗RUNX1T1、RAD23A、CAST、PRKCZ、SF3B3、SARS、DUSP6和PAIP1自身抗体）在HCC组的表达水平显著高于健康对照组（P＜0.05）,绘制ROC曲线发现,抗PRKCZ、PAIP1和CAST自身抗体诊断HCC的AUC较大,依次为0.769、0.713和0.673。在验证组血清中,上述8种TAAbs在HCC组的表达水平仍显著高于健康对照组（P＜0.05）,且抗PRKCZ、PAIP1和CAST自身抗体诊断HCC的AUC依次为0.686、0.748和0.739,抗RUNX1T1和SARS自身抗体的AUC较小,依次为0.595和0.609。4.第三阶段验证结果显示:在健康对照组、慢性乙肝组、肝硬化组和早期肝细胞癌组血清中,抗DUSP6自身抗体的表达水平逐渐增高（P＜0.05）,抗SF3B3和CAST自身抗体呈现逐渐增高趋势。5.第四阶段验证结果显示:除抗PAIP1、SARS和SF3B3自身抗体外,其他5种TAAbs均未呈现在病例组（胃癌组和食管鳞癌组）的阳性率显著高于健康对照组（P＞0.05）。6.模型的构建和验证结果显示:Logistic回归模型、并联诊断试验、支持向量机模型和经典决策树模型在训练组和验证组的Kappa值依次是0.528/0.481、0.442/0.400、0.708/0.450和0.615/0.275。比较Delong方法比较各模型在训练组和验证组诊断HCC的ROC曲线,发现Logistic回归模型和并联诊断试验较稳定（P＞0.05）。综合考虑各模型的诊断价值、诊断性能的稳定性及模型的复杂性,本研究的最优诊断模型为包括6种TAAbs（抗PRKCZ、RAD23A、PAIP1、CAST、RUNX1T1和SARS自身抗体）的Logistic回归模型,在训练组和验证组诊断肝细胞癌的AUC、灵敏度、特异度、符合率依次为0.836和0.822、75.90%和66.88%、76.92%和81.25%、0.764和0.740。7.最优模型诊断早期HCC、甲胎蛋白阴性HCC和小肝癌的AUC依次为0.844、0.824和0.804。8.GEPIA数据库分析结果显示,PAIP1 m RNA在HCC患者的癌组织中的表达水平显著高于肝正常组织（P＜0.05）。免疫组化结果显示,与癌旁组织相比,PAIP1蛋白在HCC患者的癌组织中的表达水平显著增高,且在早期肝细胞癌患者中既已升高（P＜0.05）。9.q RT-PCR和Western blot结果显示,与人正常肝细胞株L02相比,PAIP1m RNA和蛋白的表达水平在人肝癌细胞株（SMMC7721、Hep G2、Huh7、Hep3b和SNU449）中均有增高趋势。10.Transwell迁移和侵袭实验及CCK8实验结果显示,下调Hep G2和SMMC7721中的PAIP1,可显著抑制肝癌细胞的体外迁移、侵袭和增殖能力（P＜0.05）。结论1.基于人类蛋白质组芯片技术筛选候选TAAbs,并通过ELISA方法多阶段大样本验证其在HCC的潜在诊断价值的设计模式是可行的。2.基于人类蛋白质组芯片技术发现并经多阶段验证的8种TAAbs（抗PRKCZ、RAD23A、PAIP1、CAST、SF3B3、SARS、RUNX1T1和DUSP6自身抗体）在HCC的诊断中可能具有潜在应用价值,但单个TAAb对HCC的诊断价值有限,而在此基础上建立的包括6种TAAbs（抗RAD23A、CAST、RUNX1T1、PAIP1、SARS和PRKCZ自身抗体）的Logistic回归模型有较高诊断价值,且可能对早期HCC、甲胎蛋白阴性HCC和小肝癌的诊断均有潜在应用价值。3.PAIP1蛋白在早期肝细胞癌患者的癌组织中的表达水平既已显著高于癌旁组织,下调PAIP1可抑制体外肝癌细胞的迁移、增殖、侵袭能力,提示PAIP1在HCC的发生和发展中起着重要的促进作用。