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儿童中多发的龋病、牙髓疾病和根尖周疾病不仅影响儿童的咀嚼和发音功能,危及牙齿及牙列的正常发育,并且影响儿童的生理和心理健康。由于儿童正处于生长发育期,牙齿根尖多未发育完全,根尖孔呈开放状态。有别于成人的治疗方案,目前对于儿童口腔疾病的治疗手段着力于促进牙齿根尖部硬组织包括牙本质、牙骨质、牙槽骨的正常发育,使患牙能恢复正常功能。传统药物治疗对牙齿周围组织有一定损伤性,临床亟待更安全有效的方法促进根尖组织再生,近年来干细胞技术和牙组织工程的研究为儿童牙病治疗的发展提供了新思路。根尖牙乳头干细胞(Stem Cells from the Apical Papilla,SCAP)是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。研究表明SCAP是牙根发育时成牙本质细胞的主要来源,在牙根的形成和发育中起着重要的作用,是根尖组织再生比较理想的种子细胞。但鉴于细胞来源有限、数量很少等困难,本课题利用永生化根尖牙乳头干细胞(immortalized Stem Cells from the Apical Papilla, iSCAP)进行研究,细胞数量充足,生物性能良好。由于干细胞可多向分化,因此寻找促进干细胞定向成骨分化的细胞因子则一度成为骨组织再生领域研究的热点问题,其中Wnt和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)信号通路在动物胚胎发育、器官形成、组织再生过程中发挥着重要的调控作用,尤其在成骨分化方面作用更突出,目前已分离出20余种Wnt基因和14余种BMP基因。实验室前期比较19种表达Wnt蛋白的腺病毒,检测发现Wnt3、 Wnt3A激活P-catenin的转录活性最强；分析14种BMP中,BMP9在体外和体内实验都表现出对间充质干细胞最强的诱导成骨分化能力。但是,Wnt与BMP能否诱导根尖牙乳头干细胞成骨分化、两者之间是否存在“串话”以及其作用机制尚不明确。本实验研究的目的是：探究(1) Wnt3A和BMP9是否能诱导根尖牙乳头干细胞成骨分化；(2) β-catenin在Wnt3A和BMP9诱导根尖牙乳头干细胞成骨分化中是否发挥着关键的作用；(3)Wnt3A和BMP9诱导根尖牙乳头干细胞成骨分化中是否存在协同关系及可能的机制。本研究的第一部分首先将同时载有3段沉默β-catenin基因片段的质粒pMPB-simBC转染入iSCAP细胞(iSCAP-KD)中,实时定量Real-time PCR检测发现β-catenin基因沉默后目的基因mRNA表达明显降低。用腺病毒Wnt3A分别感染iSCAP-Ctrl和iSCAP-KD两种细胞,pTOP-Luc荧光素酶报告基因检测显示iSCAP-KD组β-catenin转录活性明显减弱；Real-time PCR显示β-catenin沉默后,Wnt3A通路下游靶基因c-Myc的mRNA表达降低；细胞免疫荧光染色检测显示iSCAP-KD组与iSCAP-Ctrl组相比,P-catenin核内转移明显减少,细胞质表达强度也减弱。可见,RNA干扰质粒pMPB-SimBC可有效降低β-catenin在iSCAP细胞中的表达和活性。接下来,用Wnt3A分别感染iSCAP-Ctrl和iSCAP-KD并检测细胞的成骨分化情况。结果显示,Wnt3A可促进iSCAP细胞早期成骨分化指标—碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性和表达升高,并且呈剂量依赖性,iSCAP-KD组ALP活性和表达比对照组明显下调；但茜素红染色显示晚期成骨分化指标钙盐沉积和Real-time PCR检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)在iSCAP-Ctrl和iSCAP-KD两组中均未见明显表达。说明Wnt3A可促进iSCAP细胞早期成骨分化,但对晚期成骨没有明显作用。本研究的第二部分首先用腺病毒BMP9感染iSCAP-Ctrl和iSCAP-KD两种细胞,检测BMP9对iSCAP细胞的成骨分化作用。结果显示,BMP9可促进iSCAP细胞ALP活性和表达升高、OPN和OCN表达明显、钙盐沉积结节增多,并且呈剂量依赖性；iSCAP-KD组与iSCAP-Ctrl组相比,BMP9对其诱导成骨分化作用明显减弱。可见,沉默β-catenin能抑制BMP9对iSCAP细胞的成骨分化作用。接下来通过体外和体内实验验证Wnt3A和BMP9信号通路对iSCAP细胞成骨分化的协同促进作用。结果表明,ALP活性测定显示Wnt3A和BMP9联合作用均大于单独使用Wnt3A或BMP9,且呈剂量依赖性,沉默β-catenin后两者的协同成骨能力也明显减弱；裸鼠异位成骨实验显示Wnt3A和BMP9联合作用生成骨小梁数量明显增多,骨基质连续性好,排列紧密,Masson’s Trichrome染色显示红染程度强,生成的成熟和矿化骨基质多。最后探讨了Wnt3A和BMP9信号通路协同成骨的可能作用机制。将腺病毒Wnt3A、BMP9和1β-catenin分别刺激转染了荧光素酶报告基因p6OSE2-Luc的iSCAP-Ctrl和iSCAP-KD细胞,结果显示三种病毒均可使iSCAP细胞中Runx2转录活性增强,但P-catenin沉默后Runx2不能被活化。因此,本研究推测Runx2可能是Wnt3A和BMP9协同作用的交叉点,沉默β-catenin基因会阻断其入核激活TCF1,从而无法激活Runx2。综上所述,Wnt3A和BMP9均可诱导iSCAP细胞成骨分化,两者联合应用更具有协同促进的作用,沉默β-catenin基因可明显抑制成骨表达,Runx2活化可能成为介导Wnt3A和BMP9信号通路协同作用的关键交叉点。