产气荚膜梭菌是一种人兽共患病原菌,能引起人以及多种家禽家畜发病。鸡坏死性肠炎是由产气荚膜梭菌感染引起的肠道传染性疾病,它能导致肠道出血、坏死,病鸡体型消瘦、死亡,给全球家禽养殖业造成巨大经济损失,严重阻碍了养禽业的健康发展。随着抗生素的长期和不合理使用,细菌耐药性以及耐药谱正快速增强和扩展,抗生素类抗菌药物正面临前所未有的危机。本研究根据不同的表达菌,优化并合成裂解酶Cp51基因序列;Cp51基因连接于乳酸菌质粒PNZ8148形成重组质粒后,电转化进入电感受态乳酸菌NZ9000,构建乳酸菌重组表达菌NZ9000/PNZ8148-Cp51;Cp51基因连接于枯草芽孢杆菌质粒PHT43形成重组质粒后,电转化进入电感受态枯草芽孢杆菌WB800N,枯草芽孢杆菌重组表达菌WB800N/PHT43-Cp51;Cp51基因连接于表达载体p MAL-c5X形成重组质粒,转化进入化学感受态细胞BL21,构成大肠杆菌重组表达菌BL21/p MAL-c5X-NVCp51。结果三种重组菌均能表达噬菌体裂解酶,都具备抗菌活性。重组乳酸菌大量培养,经1 ng/m L的nisin溶液进行诱导表达,亲和层析柱纯化获得浓度为124μg/m L裂解酶,用比浊法测定,证明纯化的裂解酶能将产气荚膜梭菌OD600nm值从大于0.6降至0.2,具备较强的杀菌效果;重组乳酸菌与产气荚膜梭菌体外混合培养,通过活菌计数,重组乳酸菌组与对照组比较,能将产气荚膜梭菌活菌数从109CFU/m L降至108CFU/m L,证明重组乳酸菌在体外对产气荚膜梭菌有一定抑制效果;以球虫和产气荚膜梭菌共感染动物模型评价重组乳酸菌的抗菌效果,以109 CFU/天的量连续5天灌服重组乳酸菌,与阳性组对比,重组乳酸菌组的肠道病变值降低、产气荚膜梭菌活菌数降低和球虫卵囊数降低,表明重组乳酸菌在体内对产气荚膜梭菌也有抑制效果。成功构建Cp51基因的重组枯草芽孢杆菌重组菌,用IPTG诱导后经Western blot鉴定,成功表达裂解酶,但表达量低,对产气荚膜梭菌的抑制效果较乳酸菌微弱。使用带有MBP标签的p MAL-c5X载体,以大肠杆菌表达产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51与诺如病毒衣壳的融合蛋白NVCp51,大肠杆菌重组表达菌经最优条件诱导后超声破碎,经镍填料亲和层析柱纯化,获得大量可溶性重组蛋白,蛋白质量浓量达到504μg/m L。在人工模拟胃肠液中,经人工肠液和人工胃液处理过的裂解酶,相比不处理的重组裂解酶,杀菌活性仍有70%以及74%,说明蛋白稳定性较强。计算所得,1μg重组裂解酶蛋白具备20 U裂解酶活性。比浊法试验结果表明,质量浓度稀释至1μg/m L的重组裂解酶依旧具备强杀菌活性。以球虫和产气荚膜梭菌共感染动物模型评价NVCp51重组蛋白的抗菌效果,以高剂量1000 U或低剂量100 U量两个剂量人工灌服重组蛋白NVCp51,同时设地美硝唑药物对照组,以相对增重、料肉比、病变计分、活菌计数等指标进行比较分析,结果表明,高剂量的NVCp51蛋白有明显的抗菌效果,相比阳性组,各指标差异显著,与化药地美硝唑组相当,低剂量组有抗菌效果,但效果不如高剂量组。综上所述,产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶的三种重组表达菌构建成功,重组益生菌及重组菌表达的蛋白在体内与体外均对产气荚膜梭菌有一定抑制效果。