随着人类基因组全序列的问世，以大规模分析细胞或生物体内的蛋白质为主要任务的蛋白质组研究成为后基因时代的重要研究内容。蛋白质组与基因组相对应，都是一个整体的概念，但二者又有根本不同之处。一个有机体只有一个确定的基因组，组成该有机体的所有不同细胞都共享同一个基因组；但基因组内各个基因表达的条件和表达的程度则随时间、地点和环境条件的不同而不同，因而它们表达的模式，即表达产物的种类和数量随时间、地点和环境条件也是不同的。所以，蛋白质组是一个动态的概念。它不仅在同一个机体的不同组织和不同细胞中不同；在同一机体的不同发育阶段，直至最后消亡的全过程中也在不断变化；机体处于不同生理状态下不同；在不同外界环境下也是不同的。正是这种复杂的基因表达模式，表现了各种复杂的生命活动。实际上每一种生命运动形式，都是特定蛋白质群体在不同时间和空间出现，并发挥功能的不同组合的结果。因此面对蛋白质组的多样性、可变性和复杂性，蛋白质组学面临着巨大的挑战。 目前蛋白质组学的科学研究之所以能够取得蓬勃的发展，主要依赖于大规模高通量分离、分析技术的突破性进步。在蛋白质组研究中，目前最成熟、最有效的技术仍然是双向凝胶电泳分离——生物质谱鉴定技术，即首先用双向凝胶电泳分离纯化蛋白质，结合计算机定量分析得到的电泳图谱，再进一步用生物质谱技术对分离出的蛋白质进行鉴定，并运用现代生物信息学的技术对所得到的天文数字的数据进行处理，对蛋白质以及它们执行的生命活动做出尽可能精细、准确及本质的阐述。 双向凝胶电泳虽然仍是蛋白质组研究不可替代的分离方法，但存在的一些问题依然是该技术所无法解决的。其问题主要有以下几个方面：(1)低丰度蛋白质点的检测，有许多细胞因子及功能蛋白质往往表达量很低，用目前的显色方法难以呈现，而且按目前检测到的蛋白质点数，不可能全部包括细胞内所表达的上万种甚至更多蛋白质。(2)极酸和极碱性区蛋白的分离，按目前商业化的胶条，最多能分离pH 3-11范围内的蛋白质，而且碱性区蛋白质的分离难度依然很大。(3)相对分子质量高的区蛋白的分离，由于IPG胶条在重泡胀时，相对分子质量大于10万的蛋白质很难进入胶条，这部分蛋白质也不能在双向凝胶电泳上呈现出来。(4)膜蛋白或疏水蛋白质的提取和有效分离。(5)操作过程难以实现自动化。因此我们需要发展一种真正高通量的，适应性强的，易于自动化的蛋白质组学分析新技术。文献报道的蛋白质组学策略多种多样，但是主要有两种路线：第一种是上面提到的传统的2DE蛋白分离、胶内酶解与MS鉴定相结合的方法，这也是目前最常用的一种路线。第二种即所谓的“shotgun proteomics”方法，先将混合蛋白酶解，经过适当的色谱分离手段之后，对肽段进行MS／MS分析并据此实现蛋白的鉴定。如果需要进行定量比较，可以对蛋白或肽段进行稳定同位素标记。为了提供足够的峰容量，提出了许多多维的肽段的分离体系。最常用的是肽段的两维(强阳离子交换／反相色谱)色谱分离体系。有研究表明理论上该方法可以检测到丰度很低的蛋白，尽管这需要进行仔细的实验设计和足够量的样品。 目前国际上新提出的“Top-down” proteomics利用蛋白的不同性质像等电点、分子量、疏水性和结合特异性等进行全蛋白分离分析。传统的2DE属于其中，但现在的“Top-down” proteomics采用液态多维分离手段，自动化的进行蛋白鉴定，这样解决了传统的2DE的许多难题，同样也优于“shotgun proteomics”，因为更多的有关蛋白的信息可以得到，从而对蛋白进行准确的鉴定，但是由于是全蛋白检测，蛋白的碎片信息无法获得，因此无法进行蛋白的最终确认。 本论文以蛋白的多维色谱-电泳分离-MALDI检测方法为主要方向，系统地研究了本工作涉及到的MALDI靶上蛋白快速酶解，色谱或电泳与酶解的兼容，色谱或电泳与MALDI联用等问题，最终建立并完善了以“top-down”和“bottom-up”路线特点相结合的RPLC-CIEF-on-line digestion-MALDI-TOF-MS蛋白质组学分离分析平台。 本论文共分四章。主要内容摘要如下： 第一章为文献综述，总结了蛋白质组学研究现状及发展趋势。首先详细介绍了目前蛋白质组学研究中的两大技术路线“top-down”和“shotgun”的特点和局限性，以及目前正在崛起的“top-down”和“bottom-up”融合技术路线的特点和重点突破方向。其次我们详细介绍了目前蛋白质组学研究中的主要技术手段，一是经典的双向凝胶电泳技术和生物质谱技术，二是目前正在快速发展的生物样品多维色谱分离技术及众多杂交模式，这些技术的发展极大的提高了蛋白质组学研究的自动化水平，同时更有效的提高了蛋白的鉴定水平。再次我们总结了近些年来CE-MALDI接口技术的进展，这个领域目前正在积极发展中。最后介绍了本论文选题的目的和意义，本论文紧紧围绕目前蛋白质组学研究中最有前景的“top-down”和“bottom-up”融合技术路线，积极发展蛋白的多维色谱电泳分离模式，尤其发展简单高效具有很强实用性的快速酶解技术，最终实现生物样品中全蛋白的自动分离、酶解及鉴定的分离分析平台的建立，并为蛋白质组学中的蛋白鉴定提供可能的最佳解决方案。 第二章全面的发展了MALDI靶上蛋白酶解新技术。首先详细考察研究了酶解过程中对蛋白酶解产物影响的主要因素，通过优化温度、反应时间和蛋白和酶的用量，以及缓冲体系，确定了最佳靶上蛋白酶解条件，明确了用MALDI靶上蛋白酶解进行蛋白鉴定的可行性。以不同种类的蛋白质为探针，测试评价了靶上蛋白酶解新技术的性能。结果表明，不同性质的蛋白质靶上蛋白酶解酶解迅速，都可得到高质量的MALDI质量指纹图谱，灵敏度高，对很难酶解的蛋白也有很好的鉴定。此外我们发现通过控制蛋白的不完全酶解，可以同时得到蛋白的碎片和分子量信息，这极大丰富了蛋白的鉴定信息，提高了蛋白鉴定的准确度，实际应用也证实了这一点。其次我们进行了MALDI靶上多酶酶解蛋白技术的探索，发现多酶酶解可有效提高蛋白鉴定的准确度，并且对修饰化蛋白的鉴定具有很大潜力。最后采用毛细管液相色谱和MALDI联用实现了蛋白实时分离和酶解的过程，证明了该技术的价值。再以该技术为基础，我们建立了SCX-cRPLC-MALDI的蛋白质组学分析平台，在“中国人肝表达谱项目”中得到了重要应用，为“中国人肝表达谱项目”的顺利完成做出了重大贡献。 第三章我们首次提出了建立RPLC-CIEF-MALDI蛋白质组学分离分析平台的策略。RPLC和CIEF分离技术是完全正交的，这样可以极大提高蛋白分离时的峰容量和分离效果，此外CIEF是唯一的分离与富集同时获得的分离技术，这十分有利于低峰度蛋白的检测。但是，一些关键技术问题需要解决。首先，MALDI靶上酶解技术的使用，有效的解决了CIEF-MALDI接口建立的问题，并有助于提高实验的自动化水平，同时该接口能够有效保障CIEF聚焦过程的完成以及馏分收集时CIEF的分离效率。其次，CIEF背景中的两性电解质的去除对实验的成功很关键，因为两性电解质的存在会极大的影响MALDI的信号，两性电解质的质谱峰会压制蛋白酶解产物的质谱峰。我们首次采用MALDI靶板上涂敷疏水涂层的办法，采用不同溶剂来清洗CIEF馏分，去除两性电解质，然后靶上蛋白酶解进行质谱鉴定。此外，我们继续改进MALDI靶板上去除两性电解质实验，首次采用硫酸铵盐析的办法简单有效的去除了两性电解质，同时样品的MS信号得到了增强。最后考察RPLC-CIEF分离过程中如何有效得到蛋白MW和PMF的问题，我们有三种方案可供选择，每种方案各有优缺点，同时也注意到获得蛋白MW和PMF信息的优点，最后考虑到实际样品的特点，我们选择了比较稳妥的两次实验方案，一次测MW，另一份测PMF。通过以上关键问题的有效解决，我们为建立RPLC-CIEF-MALDI蛋白质组学分离分析平台奠定了坚实的基础。 第四章是在第三章的准备工作的基础上首先建立了RPLC-CIEF-MALDI蛋白质组学分离分析平台，随后在应用该平台的过程中，不断挖掘该平台的特点，使之达到和超过2DE-MS蛋白质组学路线的特点。首先采用不同特点的标准蛋白混合物进行全系统测试，来证明该平台应用的可行性。随后然后采用鼠肝蛋白样品进一步测试，采用MALDI靶板涂层去除两性电解质的处理方法，众多全蛋白的疏水性和pI信息被同时得到，实验结果表明RPLC-CIEF-MALDI蛋白质组学分离分析平台是可行的，最后有375个蛋白被成功鉴定，因此说明了该平台在蛋白质组学发展中具有极大的应用潜力。再进一步我们继续采用鼠肝蛋白样品在RPLC-CIEF-MALDI平台上进行分离分析，采用先酶解再饱和硫酸铵溶液MALDI靶板去除两性电解质的处理方法，实验中既要同时得到了全蛋白的疏水性和pI信息，也得到了蛋白的分子量信息和酶解产物信息，最后我们鉴定了510个蛋白，因此这更说明了该平台在蛋白质组学发展中具有极大应用潜力。需要注意的是由于该平台获得了蛋白的分子量和pI信息，同时酶解产物可以准确鉴定该蛋白，因此我们可以得到类似的2DE的谱图，同时也首次超越了2DE-MS蛋白质组学技术。 总之，本论文围绕蛋白质组学的研究热点，以完整蛋白的分离分析为指导思想，发展了实用的蛋白分离分析系统和简单有效的快速酶解新技术，首次建立并完善了以反相色谱与毛细管等电聚焦电泳的全二维蛋白分离路线，再结合MALDI靶上快速酶解新技术，具有“top-down”和“bottom-up”两种策略优点相融合的技术平台。该技术平台在技术上超越了经典的2-DE-MS蛋白质组学技术平台，为蛋白质组学的进一步提供了更有效的技术手段。本工作对蛋白组学新方法学的建立进行了有益的探索和研究，重要的是一些技术和方法已经在“中国人肝表达谱项目”中得到了重要应用，同时获得了大量的宝贵的实验数据，为国家重大项目的顺利完成做出了重要贡献。