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成纤维生长因子受体家族(FGFRs)共有四个成员:FGFR1、FGFR2、FGFR3及FGFR4。四个受体分别通过与FGF结合发生级联反应,激活胞内信号从而发挥其生理功能。其中FGFR3主要负性调节软骨发育。FGFR3功能增强点突变可引起软骨发育障碍导致一系列人类骨骼遗传病:软骨发育不全(Achondroplasia,ACH),季肋发育不良(Hypochondroplasia,HCH)以及致死性软骨发育不全(Thanatophoric dysplasia,TD)。通过建立模拟人类相关遗传病的FGFR3点突变小鼠(ACH小鼠)模型,发现FGFR3增强导致骨形成过程障碍、骨量降低,同时肥大软骨细胞分化受到抑制。FGFR3敲除小鼠虽生长板增宽、肥大软骨细胞分化增强,但该小鼠与增强小鼠同样表现为骨量降低、皮质骨变薄。上述两种小鼠是在所有细胞中敲除或增强FGFR3,无法区分FGFR3在特定细胞中的作用。在骨骼发育过程中,软骨细胞、成骨细胞及破骨细胞间的串话是影响软骨内成骨过程的重要环节。在ACH小鼠模型中,软骨细胞肥大分化过程受到抑制,由成骨细胞主导的骨形成减慢。我们前期研究表明,在软骨内特异性敲除FGFR3引起BMP2/4/7表达增高,同时BMPs拮抗抑制分子Noggin表达降低;同时IHH表达增高明显。这些结果证实了软骨细胞中的FGFR3水平降低可引起促成骨细胞相关分子表达增加。但敲除FGFR3软骨细胞中的这些信号分子是否能影响成骨细胞有待进一步证实。另一方面软骨细胞能够通过与破骨细胞串话进而引起骨重塑过程的改变。但软骨细胞中缺失FGFR3后是否可以直接调节破骨吸收过程,还是先通过改变成骨细胞功能而后影响破骨吸收过程尚不清楚。因此我们拟通过成骨-软骨细胞共培养模型来明确敲除FGFR3的软骨细胞是如何调控软骨内成骨过程。FGFR3除通过调节软骨细胞功能间接影响骨形成外,也可直接影响小鼠成骨过程。参与骨形成过程中的成骨细胞主要来源于间充质细胞,历经成骨前体细胞,分化成为成熟成骨细胞。成熟成骨细胞能分泌类骨质与胞外基质。随着钙的沉积类骨质矿化,将成熟成骨细胞包埋其中。模拟人软骨发育不全的FGFR3增强型点突变小鼠模型表现为成骨细胞增殖减慢,矿化障碍,但ALP活性增高,并且进一步证实FGFR3通过P38通路抑制间充质细胞增殖,又通过ERK1/2调节矿化过程。使用Col1启动子介导的早期成骨细胞fgfr3功能增强小鼠表现为骨量明显减少,早期成骨细胞标志基因col1表达增高,但op表达无变化。这些结果均提示fgfr3能直接调控早期成骨细胞功能。但成熟成骨细胞中fgfr3功能发生改变是否会引起骨重塑过程发生变化需要进一步研究。终末成熟成骨细胞除凋亡、转变为骨衬细胞两种命运转归外,还能转变为生存于骨质中的骨细胞。骨细胞是人体骨组织中数量最多、寿命最长、分布最广的成骨系细胞。骨细胞近年来也被证实能够通过旁分泌途径调节骨重塑过程。骨细胞可以通过树突与骨质表面附着的成骨细胞及破骨细胞产生串话,传递信号。压力或化学信号刺激能引起骨细胞sost水平变化,从而影响成骨细胞分化及功能。另外骨细胞还可通过分泌rankl调节破骨吸收功能。体外和体内实验证据均表明fgfr3在骨细胞中表达,因此我们推测fgfr3可能参与骨细胞功能维持,并参与骨重塑过程。研究方法第一部分:fgfr3在骨细胞中的作用及机制研究1.建立骨细胞敲除fgfr3小鼠模型:通过将fgfr3flox/flox小鼠与dmp1-cre小鼠交配,获得子代为dmp1-cre;fgfr3flox/flox小鼠。该小鼠中fgfr3在骨细胞中被特异性敲除。dmp1-cre;fgfr3flox/flox小鼠与同窝fgfr3flox/flox小鼠于3月龄及6月龄取材,获得股骨、胫骨用于实验;2.利用免疫组化检测fgfr3与oc蛋白水平变化,同时取3月龄小鼠股骨及胫骨提取骨组织rna定量分析fgfr3的表达;3.通过数字x光成像扫描小鼠股骨、尾椎骨等观察小梁骨及皮质骨影像学变化,通过micro-ct三维重建股骨扫描数据,分别量化评估小鼠小梁骨及皮质骨;4.使用染色骨组织石蜡切片从组织学评估骨量、成骨细胞数量、成骨细胞表面积等指标,使用硬组织切片进行荧光双色双标评价骨形成速率,vonkossa染色用来观察小梁骨表面是否存在矿化差异。5.通过trap染色观察破骨细胞数量及破骨吸收表面积,同时使用骨组织rna定量检测其中rankl和opg表达变化;6.tunel法用以检测骨组织中骨细胞凋亡情况。第二部分:成熟成骨细胞中fgfr3的功能研究1.建立成熟成骨细胞内特异性敲除fgfr3小鼠模型并观察其整体表型;2.利用x线观察成熟成骨细胞内特异性敲除fgfr3小鼠骨骼表型,micro-ct扫描重建则用于评估敲除小鼠骨骼相关指标,明确其骨量变化;3.荧光双标检测敲除小鼠骨形成速率,vonkossa染色用于观察小鼠骨量及未矿化类骨质有无异常沉积,oc免疫组化用于观察成骨细胞功能;4.使用trap染色观察成熟成骨细胞内特异性敲除fgfr3后小鼠破骨细胞形成情况;第三部分:fgfr3通过旁分泌作用调节骨形成1.成骨-软骨细胞共培养细胞体系的建立:我们分离了出生后1-3天的fgfr3flox/flox小鼠(wt)和col2-cre;fgfr3flox/flox(mut)小鼠原代软骨细胞和wt小鼠颅骨原代成骨细胞。通过trans-well共培养系统,上层分别接种wt和mut小鼠原代软骨细胞,下层接种wt颅骨原代成骨细胞进行实验;2.通过茜素红及alp染色观察成骨-软骨细胞共培养下层成骨细胞矿化情况及alp阳性细胞数量,并且通过alp定量检测alp活性是否发生变化;3.提取共培养14天的原代成骨细胞rna,反转后通过定量pcr检测成骨相关基因cbfa1、col1、oc的表达观察成骨细胞功能变化;4.提取原代软骨细胞rna并定量检测软骨细胞中rankl和opg表达变化,同时使用上述共培养体系下层原代成骨细胞rna定量检测成骨细胞中rankl和opg水平变化,明确引起mut小鼠破骨吸收功能降低的原因;5.提取成骨-软骨细胞共培养上层原代软骨细胞rna,定量检测tgf-β1、tgf-βi、wnt2、wnt3、wnt4、wnt5b表达,探寻软骨细胞中fgfr3影响骨形成的潜在细胞串话机制。实验结果:一、fgfr3在骨细胞中的作用及机制研究1.使用dmp1启动子驱动的cre工具小鼠可在骨细胞中有效敲除fgfr3;2.骨细胞fgfr3失活(dmp1-cre;fgfr3flox/flox)引起小鼠骨量降低,骨小梁厚度及数量减少,骨小梁间隙增宽,同时皮质骨厚度变薄,皮质骨骨体积减少;3.骨细胞内fgfr3失活后,骨小梁双色双标间距变窄,骨形成速率减慢;4.dmp1-cre;fgfr3flox/flox小鼠与同窝fgfr3flox/flox小鼠相比,骨小梁表面成骨细胞数量减少明显,成骨细胞铺展表面积降低,髓腔内侧皮质骨表面成骨细胞形态变为扁平,提示其生成骨能力减弱;5.dmp1-cre;fgfr3flox/flox小鼠小梁骨及髓内侧皮质骨破骨细胞增多、破骨吸收表面积增加显著,同时骨组织rna结果提示rankl/opg增高,提示dmp1-cre;fgfr3flox/flox小鼠破骨吸收能力增强;骨细胞凋亡无明显改变。二、成熟成骨细胞中FGFR3的功能研究1.成熟成骨细胞内特异性FGFR3功能失活小鼠体型变短,体重减轻,同时骨量降低显著;2.成熟成骨细胞内特异性敲除FGFR3小鼠骨形成障碍,成骨细胞数量降低,同时OC表达降低,成骨细胞分化能力减弱;3.成熟成骨细胞内特异性FGFR3功能失活小鼠破骨吸收能力无变化;三、FGFR3通过细胞间串话调节软骨内成骨过程1.通过成骨-软骨细胞共培养后,成骨细胞矿化能力增强,ALP活性增高,同时成骨相关标志基因Col1、OC、Cbfa1表达增高;2.除软骨细胞Ihh、Bmp2/4/7增高,Noggin降低以外,Wnt-4、TGF-β1表达增高;3.成骨-软骨细胞共培养下层成骨中RankL/Opg无显著差异,但原代软骨细胞中RankL/Opg比例增加。结论:一、骨细胞敲除FGFR3后可引起骨形成降低,破骨细胞形成增加,导致骨量降低;二、成熟成骨细胞中敲除FGFR3引起成骨细胞分化减弱,骨形成过程障碍;三、FGFR3能够通过软骨与成骨、破骨细胞间串话影响骨重建过程。