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目的:了解安徽省产CTX-M酶肺炎克雷伯菌对常用抗菌药物的耐药情况,揭示其相关耐药机制,指导临床合理用药。了解安徽省部分医院CTX-M型β-内酰胺酶的基因型,研究新型CTX-M酶的分子生物学特性。材料与方法:安徽省细菌耐药性监控中心收集2006年随机月份34所医院住院和门诊患者的各种临床送检标本,无重复分离临床产ESBLs的肺炎克雷伯菌共105株。以105株ESBLs+菌株总DNA为模板,使用blaCTX-M通用引物进行PCR扩增以筛选出CTX-M+菌株;将PCR阳性的菌株行转移接合试验,并行全编码引物PCR扩增。对多次测序并经GenBank比对后确定的产新酶菌株进行以下实验:PCR扩增野生株和/或转移接合子中的CTX-M型β-内酰胺酶编码基因片段,克隆入pUC-118载体,表达于感受态细胞大肠埃希菌JM109中,再次测定核苷酸序列,结果至GenBank比对,进行DNA序列分析。将新酶全编码基因克隆入表达载体pHSG398,转化于感受态细胞大肠埃希菌JM109中,用加有抗菌药物的琼脂平板进行转化株筛选。用琼脂倍比稀释法对野生株和转化株同时进行MIC测定。采用超声破碎法进行产新酶细菌转化株的粗酶提取,等电聚焦电泳测定其等电点(pI)。对粗酶纯化后,SDS-PAGE和考马斯蓝染色测定新酶分子量大小;ERIC-PCR法分析产细菌的同源性;进行酶促反应动力学研究,以初步了解新酶的动力学特性。结果:52株肺炎克雷伯菌经通用引物PCR检测证实产CTX-M酶,占所有分离菌株的23.4%(52/222),占产ESBLs菌株的49.5%(52/105);经序列分析表明:15株CTX-M-1组阳性结果有12株表达CTX-M-22,2株表达CTX-M-15,1株表达CTX-M-3;37株CTX-M-9组阳性结果有35株表达CTX-M-14,2株表达CTX-M-24;CTX-M-2组和CTX-M-8组未检测出;其中有两株新基因被检出(序列号分别为EU136031,EU202673);药敏结果显示临床野生菌株对多种β-内酰胺类耐药,对哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、头孢他啶相对较敏感。产新型质粒介导CTX-M酶菌株的转移接合试验和克隆表达试验均取得成功,其野生株及转化株的MIC结果显示:野生株和转化株有着几乎相同的耐药谱,但转化株对抗生素的耐药性有所下降。产新型质粒介导CTX-M酶细菌转化株的等电聚焦及SDS-PAGE结果显示,其等电点在8.1、8.4左右,蛋白质分子量约为28kDa左右;ERIC-PCR显示两菌株不具有同源性;酶促反应动力学研究,初步了解新酶对5种常用抗菌药物的Km值和Vmax值,结果显示:该酶对头孢他啶的水解效率最低,结论:安徽地区CTX-M酶以CTX-M-14型和CTX-M-22型为主,同时存在变异型;药敏结果显示产酶菌株对头孢噻肟和头孢曲松、氨苄西林高度耐药,但转化株对抗生素的耐药性有所下降;ERIC-PCR显示新酶菌株不存在明确的遗传关系。另外,产新酶菌株可通过质粒在不同菌株之间传递,因此有必要加强本地区产质粒介导CTX-M酶菌株的监测并同其他地区进行耐药资料的交换,以形成大的耐药监测网,这些工作对于阻止耐药基因的传播有重要的流行病学意义。