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中心蛋白是一种分子量约为20 kD的酸性蛋白,属于高度保守的钙调蛋白EF-hand超家族,广泛存在于多种生物体,如酵母、藻类、原生动物、高等植物和哺乳动物等的中心体(基体或纺锤极体)中,参与中心体的复制与分离、纤维的收缩和鞭毛切除等过程。八肋游仆虫中心蛋白(EoCen)由两个相对独立的区域(N端和C端)组成,每端包含两个EF-手结构域和两个钙离子结合位点。为了研究八肋游仆虫中心蛋白N端loop区首个氨基酸的生物功能,我们通过分子生物学方法构建了N端半分子的突变体N-D37K和N-D73K(D是天冬氨酸,K是赖氨酸)。首先利用PCR技术,在全分子突变体D37K的基础上通过截短构建得到了N端突变体N-D37K,然后通过定点突变的方法构建得到了另一个N端突变体N-D73K。DNA序列测定表明所得突变体只有目的位点的基因发生突变,而无其他任何位点的随机突变。将重组质粒导入大肠杆菌BL21感受态细胞中,在诱导剂IPTG的诱导下实现目的蛋白的可溶性表达。融合蛋白通过PPase酶切和GST亲和层析后得到纯的目的蛋白。同时将野生型蛋白(EoCen)和课题组之前构建完成的N端野生型蛋白(N-EoCen)诱导表达纯化得到目的蛋白。经SDS-PAGE分析显示,所得蛋白均不含杂蛋白条带,达到实验所需的纯度。本文运用荧光、电泳和电化学等方法研究了中心蛋白N端及其突变体与金属离子(Ca2+/Tb3+)的结合性质。铽离子荧光敏化实验和共振光散射实验证明,N-D73K可以结合两个Tb3+,这与N端野生型N-EoCen一致,而N-D37K只能结合一个Tb3+。同时,我们得到了Tb3+与中心蛋白Ⅱ部位的结合常数KⅡ-Tb=(8.31±0.18)×104M-1。通过Ca2+与Tb3+竞争N-D37K的结合位点的实验,我们得到了Ca2+与中心蛋白Ⅱ部位之间的结合常数KⅡ-Ca=(0.94±0.12)×102M-1。用TNS作为疏水探针,我们研究了中心蛋白N端及其突变体结合金属离子后的构象变化,与N-EoCe、N-D73K相比,N-D37K的构象几乎不发生变化,同时得到了TNS与Tb3+饱和的N-EoCen和N-D37K的结合常数,K(Tb3+-N-D37K-TNS)=(6.57±0.89)×106M-1和K(Tb3+-N-EoCen-TNS)=(9.35±0.05)×105M-1。通过共振光散射实验和化学交联实验,我们对N-EoCen、N-D73K、N-D37K的聚集性质的研究发现：与N-EoCen、N-D73K相比,N-D37K几乎不聚集。另外,我们还对影响聚集的其他物理化学因素做了研究。总的研究结果表明,当loopI区的第一个氨基酸Asp37突变为赖氨酸后,N-EoCen的第一个金属离子结合位点丧失了金属结合能力,进而影响了中心蛋白N端依赖于金属离子的构象变化和聚集性质,表明Asp37对EoCen的N端金属结合起重要作用。Eu3+在-0.2V～-1.2V电位扫描范围内具有较好的电化学活性,本文利用Eu3+灵敏的电化学行为初步对中心蛋白N端的金属离子结合性质进行了研究。