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ATP合酶(F0F1-ATP酶)是生物体内负责能量转化的酶，现已证明是一个旋转分子马达，包括“定子(ab2δα3β3)”和“转子(γεcn)”两部分。以往对于F0F1-ATP酶旋转的单分子研究主要集中于ATP水解驱动的亚基旋转，而对于质子梯度驱动的F0F1-ATP酶旋转直接观察与力学问题，一直缺乏实验证据。本文建立了质子梯度驱动F0F1-ATP酶亚基旋转的单分子研究体系，观察了光诱导形成的跨膜质子梯度驱动F0F1-ATP酶亚基的旋转。具体研究内容如下：
1)纯化了高活性嗜热菌BacillusPS3F1-ATP酶，并通过它的β亚基上的10×His尾巴而固定在玻璃板上，然后在其γ亚基上连接荧光标记的肌动蛋白微丝，加入ATP后，观察到ATP水解驱动的荧光微丝的逆时针方向旋转，计算旋转力矩为59±21pN·nm。
2)跨膜质子梯度驱动的ATP合成需要ATP合酶全酶和质子梯度的参与。根据F0F1-ATP酶的结构以及“定子”和“转子”的构成特点，在ATP合酶全酶“转子”上连接微丝或微球的方法直接观察质子梯度驱动的F0F1-ATP酶旋转在目前的技术条件下十分困难。为此，我们将chromatophores中缺失δ亚基F0F1-ATP酶的“定子”和“转子”进行重构：用NaN3和ADPMg2+固定转子(γεcn)与α3β3之间的相对旋转，得到了新的转子α3β3γεcn，建立了可以连接微丝或微球的亚基旋转单分子观测体系；并直接观察质子梯度驱动的F0F1-ATP酶亚基旋转。
①生化研究表明，经LiCl处理的光合细菌R.rubrumchromatophores与嗜热菌BacillusPS3β10×His-tag亚基重组得到杂交体中的F0F1-ATP酶缺失少量δ亚基，将荧光蛋白微丝连接在上述杂交体的β亚基上，将此体系固定，光照一段时间后，观察到荧光微丝的旋转。
②由于①中得到的缺失δ亚基F0F1-ATP酶比例较少，为此我们纯化得到去δ亚基的F1，然后将其重组到去掉F1的光合细菌Rb.capsulaluschromatophores上，得到完全缺失δ亚基的F0F1-ATP酶。利用β亚基的抗体将荧光微丝连接在重组体β亚基上，经过光照后，观察到荧光微丝的逆时针时针方向旋转。计算平均旋转力矩大约为26pN·nm。通过这两部分实验证明了光诱导所形成的跨膜质子梯度推动的F0F1-ATP酶亚基复合体的旋转。
3)此外，用氧化还原交联(cross-linking)方法估计跨膜质子电动势(PMF)在完整F0F1-ATP酶产生的旋转力矩。文献报道突变F1(αP280CγA285C)水解ATP产生的旋转力矩能够解开γ亚基最上部的α-helix，而不能断开二硫键。我们的生化研究表明，突变MM10菌株(αP280CγA285C-F0F1)的膜囊泡经CuCl2氧化后(产生的二硫键位于γ亚基的最上端)，其ATP合成活性几乎不受影响，表明氧化磷酸化时，PMF驱动γεcn旋转产生的旋转力矩也能够解开γ亚基最上部的α-helix，克服了Ramachandran能障(25-30kJ/mol，40-50pN·nm)，而不能断开二硫键(200kJ/mol，330pN·nm)。从而估计PMF在完整功能F0F1-ATP酶产生的旋转力矩范围：大于40-50pN·nm，也一定小于330pN·nm。
4)对F0F1-ATP酶作为分子马达的应用进行了初步探索。利用pH变化敏感的脂类荧光染料Fluorescein-DHPE(F-DHPE)标记chromatophores外表面。通过荧光强度变化表征ATP水解引起的质子向chromatophores内部的转运。当在chromatophores上连接β亚基的多克隆抗体以及连接二抗时，荧光强度变化受到不同程度的影响。因此，F-DHPE可能应用于研究F0F1-ATP酶的质子转运活性；这个体系的进一步完善将可以作为有应用前景的生物传感器。