论文部分内容阅读
目的:副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus, V. p)主要分布于沿岸海水、海河交界处及海产品中,是引起沿海地区食物中毒的主要病原微生物,而采用一般的细菌培养分离方法很难从环境样品(海水、海泥)中检出神奈川现象阳性并且产生耐热直接溶血毒素(Thermostable Direct Hemolysin,TDH)副溶血性弧菌。本课题研究TDH阳性副溶血性弧菌在海水、海泥中的分布及如何提高海水、海泥中病原性副溶血性弧菌的检出率,从而为预防由副溶血性弧菌引起的食物中毒的提供依据。方法:用MPN法检测静冈县海水、海泥中副溶血性弧菌数。三次增菌后采用PCR法检测样品培养液中tdh遗传因子的有无,用K型血清致敏免疫磁珠进行对带有特定K型抗原副溶血性弧菌的浓缩收集,再通过接种于神奈川现象培养基,挑选出致病性的产生TDH的副溶血性弧菌。对分离到的TDH阳性副溶血性弧菌菌株进行脉冲场凝胶电泳比较。结果:海水、海泥中副溶血性弧菌数量7月份～9月份最多,与副溶血性弧菌食物中毒多发季节相一致,每100ml海水及每100g海泥中7、8、9三个月的副溶血性弧菌MPN值均在103以上,tdh阳性的副溶血性弧菌数约占海水、海泥中副溶血性弧菌总数的1/1000~1/100,有时甚至在1/1000以下。由PCR法测得45.5%(5/11)的海水及36.4%(4/11)的海泥中的副溶血性弧菌带有tdh遗传因子。对tdh阳性检体培养液用免疫磁珠对带有特定K抗原的菌株进行浓缩、收集后,接种于神奈川现象培养基,分别从1份海水和1份海泥中检出神奈川现象阳性并且产生TDH(反相被动血球凝集结果均为阳性反应)的副溶血性弧菌,血清型为O3:K6。该血清型与同年静冈县境内发生的V. p食物中毒患者分离菌株中检出率最高的血清型一致。经SfiⅠ, NotⅠ限制性内切酶处理后,脉冲场凝胶电泳比较,海水与一名患者分离菌株、海泥与另外两名患者分离菌株的PFGE指纹基本相同。三次增菌培养后的副溶血性弧菌O3:K6菌株分离率高于仅用碱性蛋白胨水增菌的。同一份样品、同样进行三次增菌培养经免疫磁珠处理后的O3:K6菌株分离率高于未经处理的。这说明免疫磁珠法对带有特定K型抗原的副溶血性弧菌起到了明显的浓缩和收集作用。结论:与一般的细菌培养分离法相比,三次增菌培养法、PCR法、免疫磁珠法和神奈川现象的结合使用,可提高海水、海泥中病原性副溶血性弧菌的检出率。脉冲场凝胶电泳结果从分子生物学的角度表明了海水、海泥TDH阳性副溶血性弧菌O3:K6菌株与食物中毒患者分离菌株的同源性。本课题为解决难于从环境样品中分离出TDH阳性副溶血性弧菌的问题提供了有效手段,也为研究TDH阳性副溶血性弧菌在环境中的分布及由其引起的食物中毒的预防提供了重要依据。