鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci,C.psittaci)是重要的人兽共患病原之一,感染后以巨噬细胞为转运工具向全身各器官传播,欧美国家优先把C.psittaci列为潜在的生物武器。近年来,我国家禽呼吸道病呈现季节性流行,临床死亡率达到30%-40%,引发抗菌素的滥用和食品安全危机。发病鸡群中常常分离出H9N2亚型禽流感病毒、鹦鹉热衣原体和大肠杆菌。康复鸡群中鹦鹉热衣原体、偏肺病毒和鼻气管鸟疫杆菌呈现较高的血清阳性率。因此,探索鹦鹉热衣原体、H9N2禽流感H9N2在家禽持续性呼吸道中的作用机制可以为防控家禽呼吸道疾病提供理论基础。衣原体多型外膜蛋白家族(Polymorphic membrane proteins,Pmps)存在于所有衣原体种属中,并已证明沙眼衣原体Pmps蛋白家族中的PmpD是毒力因子,但是禽鹦鹉热衣原体PmpD是否具有类似的作用,是否抑制巨噬细胞功能并在衣原体免疫逃逸中发挥作用?因此,本研究提出以下科学假说:(1)C.psittaci通过分泌PmpD-N直接抑制巨噬细胞功能而降低巨噬细胞杀灭C.psittaci和H9N2的效率;(2)分泌的PmpD-N通过与Toll-like受体结合激活TLRs/MyD88/NF-KB信号通路,诱导Th1/Th2的失衡而下调巨噬细胞的先天性免疫功能,衣原体实现免疫逃避而扩散感染。为了验证以上科学假说,本课题开展以下研究工作:(1)C.psittaci与H9N2单独、混合感染对SPF鸡致病力的影响;(2)体外试验验证C.psittaci与H9N2单独、混合感染对巨噬细胞HD11的影响以及TLRs相关信号通路的表达特点;(3)C.psittaci分泌的PmpD-N作用巨噬细胞HD11后相关TLRs/MyD88/NF-KB信号通路表达特点以及Th1/Th2型细胞因子表达特点。同时,以siRNA干扰和信号通路的拮抗剂验证以上结论。试验1:C.psttaci与H9N2单独、混合感染对SPF鸡致病性的影响。以不同致病力C.psittaci感染SPF鸡,试验发现高致病力C.psittaci感染后鸡群新城疫抗体水平显著下降(P<0.01)。C.paittaci和H9N2同时感染、先感染Cp.ittaci后感染H9N2,鸡群体重、免疫器官指数和细胞因子表达水平均显著降低,死亡率和免疫器官损伤加重(P<0.01),靶组织中H9N2病毒载量显著性增高(P<0.01)。这种感染模型不但复制了家禽严重的呼吸道病和诱导较高的死亡率,而且发现高致病力的C.psittaci可以造成体液免疫和细胞免疫下调,导致机体免疫功能受到抑制,从而有助于H9N2病毒的继发感染。试验2:C.psittaci与H9N2单独、混合感染对巨噬细胞HD11功能的影响。以鸡巨噬细胞HD11细胞系为研究对象,采用不同顺序感染C.psittaci或H9N2。结果显示,初次感染C.psittaci会显著提高H9N2病毒感染细胞的死亡,降低HD1]细胞的吞噬能力和iNOS活性(P<0.01)。同时,C.psittact感染会显著下调H9N2诱导的巨噬细胞促炎性细胞因子的表达(P<0.01)。试验3:鹦鹉热衣原体PmpD-N蛋白对HD11巨噬细胞功能的影响。首先构建了pmpD-N基因的真核表达质粒pEGFP-N1-pmpD-N,将重组质粒导入HD11细胞中,RT-PCR方法证明转染重组质粒pEGFP-N1-pmpD-N的HD11细胞能够编码PmpD-N蛋白的mRNA;Western Blot证实pmpD-N基因在HD11细胞中得到表达。其次,分别以PmpD-N和重组真核表达质粒pEGFP-N1-pmpD-N与HD11细胞作用,以LPS为阳性对照,利用荧光抗体染色技术测定衣原体的感染量,以荧光微球法测定HD11细胞吞噬功能,采用Griess法检测细胞培养液上清中NO的含量。结果显示PmpD-N与HD11作用后显著降低衣原体的感染和吞噬能力(P<0.01),并不提高NO的分泌水平(P>0.05),显著上调细胞因子IL-6、IL-10以及模式识别受体TLR2、TLR4和TLR5的mRNA表达水平(P<0.01),其中以TLR2上调水平最为显著,MyD88和转录因子NF-κB的mRNA表达水平也有不同程度的提高,这提示PmpD-N激活了 TLR2/MyD88信号通路并诱导Th2型细胞免疫应答。试验4:TLR2/MyD88/NF-κB信号通路参与PmpD-N下调HD11功能的验证。分别以PmpD-N、pEGFP-N1-pmpD-N 与 HD11 细胞作用,以 LPS 为阳性对照。Western Blot 方法检测 TLRs、MyD88的表达特点,以Confocal技术检测NF-κBp65激活向细胞核迁徙特点,以EMSA检测p65与特异性DNA靶向结合情况,分析NF-κB进入细胞核后启动目的基因转录的情况。利用RNA干扰和NF-κB抑制剂PDTC,验证信号通路分子被干扰或阻断后PmpD-N刺激对HD11功能影响的变化。结果显示TLR2、MyD88表达显著上调(P<0.01),p65向细胞核内迁移并与相应的启动子基因结合后启动基因的转录,证实激活了 TLR2/MyD88/NF-κB信号通路。采用RNA干扰技术干扰TLR2、MyD88和使用抑制剂阻断NF-κB后,由PmpD-N刺激HD11细胞产生的IL-6、IL-10水平显著下调(P<0.01),PmpD-N诱导HD11细胞后Th1/Th2平衡出现新的状态。综上所述,本研究整体动物试验不但为家禽呼吸道发病提供了良好的发病模型,且首次证实,鹦鹉热衣原体和PmpD-N通过直接下调巨噬细胞功能导致鸡免疫功能下降,从而更有利于禽流感H9N2的发病。体外试验和验证试验显示PmpD-N下调巨噬细胞功能还可以依赖于间接途径:通过调控TLR2/MyD88/NF-κB信号通路和诱导Th1/T2失衡,下调HD11巨噬细胞功能,从而有利于衣原体在HD11细胞中的存活实现免疫逃逸。