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研究背景和目的:肿瘤的发生发展是一个多因素作用、多基因参与、经历多个阶段的复杂生物学过程,有许多信号分子参与其中。积极探讨这些信号分子对细胞的作用和机制,及其信号分子之间的相互关系,将有助于阐明肿瘤的发生发展机制。S100蛋白家族是一类具有EF-手形结构的信号分子,有25个成员,与钙离子及其靶蛋白结合后发挥多种生理功能,参与细胞增殖和分化、钙稳态、蛋白质磷酸化、酶活性和转录因子的调节。其中21个成员的基因定位于人染色体lq21,该区段染色体稳定性差,易发生多种染色体重排和基因扩增。现已发现多个S100成员在肿瘤中表达异常,并与肿瘤的增殖、浸润转移和凋亡密切相关,S100A2和S100A6就是其中的两个成员。S100A2在多种肿瘤中表达减少或缺失,如恶性黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等肿瘤,且S100A2的缺失表达与多种肿瘤的发生、转移有关,消减杂交也提示S100A2为肿瘤抑制因子;但也有相反报道。S100A6蛋白最初由Kuznicki和Filipek在Ehrlich腹水瘤中检出。它在多数上皮肿瘤(如黑色素瘤、肝癌、结直肠肿瘤、胰腺癌、胆管癌)、多数骨肉瘤、卵巢癌、ras转化的NIH3T3细胞、SV4O转化的鼠成纤维细胞和人急性粒细胞白血病等许多肿瘤中高表达,但它与肿瘤发生发展的关系尚不明确。为了进一步探讨S100A2和S100A6对肿瘤细胞的作用及其可能的机制,本课题拟通过重组蛋白直接作用的方式和/或腺病毒转入基因的方式,研究人S100A2和S100A6对人结肠癌细胞株HCT116和人骨肉瘤细胞株MG63细胞的增殖、迁移、细胞周期和凋亡等的影响,并对其作用机制进行初步探讨。希望能够为阐明S100A2和S100A6对肿瘤细胞的生物学作用及其机制提供实验依据,为发现肿瘤诊断和预后判断的新标志物以及肿瘤治疗的新靶点奠定基础。方法:1. hS100A2和hS100A6蛋白的鉴定和制备:双酶切鉴定pGST-Moluc-hS100A2和pGST-Moluc-hS100A6后,将二者转化大肠杆菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导S100A2和S100A6蛋白表达,谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠(Glutathione Sepharose 4B beads)分离纯化、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western blot鉴定这两种重组蛋白,Bradford法定量,分装后-80℃保存备用。2.利用HEK293细胞扩增携带S100A6基因的重组腺病毒(AdS100A6),并用SDS-PAGE/ Western blot鉴定在感染了AdS100A6的HCT116中S100A6的表达。3. GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、GST-hS100A2、GST-hS100A6、表达GFP的重组腺病毒(AdGFP)、AdS100A6分别作用人结肠癌细胞株HCT116和人骨肉瘤细胞株MG63后(其中,蛋白终浓度为40μg/ml),分别用MTT法和台盼兰染色/细胞计数法检测HCT116和MG63细胞的增殖情况;流式细胞术检测细胞周期改变(PI染色)和凋亡的发生(AnnexinⅤ-PE+细胞活性检测试剂7AAD);Transwell小室检测细胞的迁移能力;激光共聚焦技术观察细胞内β-catenin的变化。结果1 . XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切pGST-Moluc-hS100A2和pGST-Moluc-hS100A6后,均出现约300bp和9kb的片段,与其限制性内切图谱相符;诱导表达、分离纯化后的重组蛋白经过SDS-PAGE/ Western blot鉴定,分别出现相应的阳性杂交条带。表明这两个表达质粒构建正确,能表达出相应蛋白hS100A2和hS100A6;Bradford法蛋白定量,计算出hS100A2和hS100A6的获率分别为5mg/L菌液和3 mg/L菌液。2.在感染了AdS100A6的HCT116裂解液中,用SDS-PAGE/ Western blot法检测到hS100A6的存在。表明AdS100A6携带的hS100A6基因能够正常表达。3.外源性S100A2和S100A6对细胞增殖的影响hS100A2和hS100A6分别作用HCT116时,hS100A2的重组蛋白组于第4天始出现细胞增殖抑制,与GST组的差异有显著性(P<0.05);hS100A6重组蛋白组于第5天出现增殖抑制(P<0.05),AdS100A6组于第2天起,细胞数相对减少,与对照AdGFP组的差异有显著性(P<0.05)。即hS100A6的重组蛋白和AdS100A6两种作用方式均显示出对HCT116细胞增殖的抑制作用。同时,hS100A2和hS100A6分别作用MG63后,细胞增殖能力的变化与HCT116相似。上述结果提示:hS100A2和hS100A6对HCT116和MG63均有一定的抑制增殖作用;S100A6以重组蛋白直接作用与基因转入的方式对细胞增殖的作用一致。4.外源性S100A2和S100A6对细胞周期的影响: hS100A2和hS100A6分别作用HCT116后72h:hS100A2蛋白组的G0-G1期和S期的细胞分别是GST组的121%和58%,差异均具有显著性(P<0.05);hS100A6蛋白组的G0-G1期和S期的细胞分别是GST组的118%和67%,差异均具有显著性(P<0.05);AdS100A6组的G0-G1期和S期的细胞分别是AdGFP组的134%(P<0.05)和59%(P>0.05),S期呈降低的趋势。同时,hS100A2和hS100A6分别作用MG63后,细胞周期分布的变化与HCT116相似,表现为G0-G1细胞增加,S期细胞减少。上述结果提示:hS100A2和hS100A6对HCT116和MG63有一定的细胞周期阻滞作用,表现为G0-G1期细胞增加,S期细胞减少;S100A6以重组蛋白直接作用与基因转入的方式对细胞周期的作用一致。5.外源性S100A2和S100A6对HCT116凋亡的影响: hS100A2和hS100A6重组蛋白作用HCT116细胞48h时,凋亡率分别是对照组的2.3倍和2.0倍,差异显著(P<0.05);AdS100A6组的凋亡率是对照组的1.13倍,呈增加趋势。提示hS100A2和hS100A6有促进HCT116细胞凋亡的作用;S100A6以重组蛋白直接作用与基因转入的方式对细胞凋亡的作用一致。6.外源性S100A2和S100A6对细胞迁移能力的影响: hS100A2重组蛋白分别作用HCT116和MG63细胞60h后,穿过膜的细胞数分别较各自对照组减少75%和83%,差异均具有显著性(P<0.01)。提示hS100A2对HCT116和MG63细胞有较强的迁移抑制作用。hS100A6重组蛋白分别作用HCT116和MG63细胞60h后,其穿过膜的细胞数分别较各自对照组减少14%和33%;AdS100A6组(48h)分别较各自对照组减少56%和37%,差异均有显著性(P<0.01)。提示hS100A6能明显抑制HCT116和MG63细胞的迁移,其重组蛋白直接作用与基因转入的方式对细胞迁移能力的作用一致。7.两种重组蛋白作用MG63后,免疫荧光染色,Leica Confocal Software计算各组细胞的平均荧光强度:hS100A2组、hS100A6组分别是对照组的1.5和1.6倍,差异有显著性(P<0.05);激光共聚焦显微镜与透射光镜下观察:GST组的β-catenin主要位于胞浆中和核膜上,核内β-catenin集中呈现1~2个亮点,似聚集在核仁部位;细胞核膜完整,核仁1~2个;两实验组细胞内β-catenin的变化相似:胞浆β-catenin荧光着色增强,核内β-catenin也明显增加,呈现3～4个亮点,似位于核仁;但是,原来位于核膜上的β-catenin明显减少甚至消失,并且细胞核膜欠完整,多数细胞内的核仁为3~4个。结论:1.S100A2和S100A6能一定程度地抑制人结肠癌细胞株HCT116和人骨肉瘤细胞株MG63的增殖、改变其细胞周期分布(G0-G1期细胞增加,S期细胞减少)和促进细胞凋亡;其中,对细胞周期和细胞凋亡的作用可能参与了S100A2和S100A6对细胞增殖的抑制。2.S100A2和S100A6能较明显地抑制人结肠癌细胞株HCT116和人骨肉瘤细胞株MG63的运动迁移能力,其中S100A2的作用更强。3.S100A2和S100A6能增加骨肉瘤细胞株MG63细胞内β-catenin的总含量,并改变其分布,最终表现为胞浆和胞核内β-catenin表达增加,核膜上的表达明显减少,胞核中的表达似聚集在核仁。4.外源性S100A6以重组蛋白直接作用的方式与以基因转入的方式均有同样活性。提示S100A6是又一个能够在细胞外发挥作用的S100家族成员;如用于临床目的,两种作用方式均适用。本课题通过MTT法或台盼兰/细胞计数法、流式细胞术、Transwell小室探讨了S100A2和S100A6作用于人结肠癌细胞株HCT116和人骨肉瘤细胞株MG63后细胞增殖能力、细胞周期、凋亡和迁移能力的变化,并用激光共聚焦技术探讨了细胞内β-catenin的变化,发现S100A2和S100A6能够一定程度地抑制HCT116和MG63的增殖、阻滞细胞周期和促进凋亡,后二者可能是其抑制细胞增殖的部分机制;S100A2和S100A6能明显地抑制HCT116和MG63的迁移; S100A2和S100A6能增加骨肉瘤细胞株MG63细胞内β-catenin的总含量,并改变其分布;同时,首次报道了S100A6的细胞外作用。本研究及其结果为阐明S100A2和S100A6对肿瘤细胞的生物学作用及其机制提供了实验依据。