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研究背景脓毒症急性肾损伤是危重病人常见的临床并发症之一,可作为一项独立危险因素影响患者预后,给患者及社会带来巨大负担。脓毒症AKI病理生理学发病机制复杂,其中越来越多的研究显示:肾小管上皮细胞凋亡及细胞自噬功能异常在脓毒症AKI发病过程中起重要作用。近来,新的研究发现:细胞外组蛋白作为损伤相关模式分子(damage-associated molecular patterns,DAMPs),是介导脓毒症器官功能障碍的重要介质,包括脓毒症AKI。我们前期工作发现:组蛋白可以线粒体凋亡途径诱导肾小管上皮细胞凋亡。那么改善组蛋白诱导的肾小管上皮细胞损伤也许是防治脓毒症AKI的新思路。乌司他丁(Ulinastatin,UTI)是从尿液中分离纯化而来的一种广谱蛋白酶抑制剂,大量临床研究证实乌司他丁对脓毒症、急性肺损伤、重症急性胰腺炎、部分肝切除术后肝功能、心肺旁路术后急性肾损伤、术后认知功能障碍、多器官能障碍综合征等具有良好疗效,而具体机制有待进一步研究。众多研究显示乌司他丁具有广泛的生物学效应,如稳定细胞溶酶体膜、抑制溶酶体酶的释放、抑制炎症瀑布样反应、清除氧自由基、保护线粒体等机制发挥器官保护作用。那么,乌司他丁对组蛋白诱导的肾小管上皮细胞损伤起保护作用,值得探究。研究目的1.明确乌司他丁(UTI)是否对组蛋白(CTH)诱导的肾小管上皮细胞损伤起保护作用;2.初步探讨乌司他丁(UTI)减少组蛋白(CTH)诱导肾小管上皮细胞损伤的可能作用机制。研究方法1.用CCK-8法检测不同浓度组蛋白及一定组蛋白浓度处理不同时间,UTI及CTH对HK-2细胞活性的影响。2.Annexin V FITC/PI双染流式细胞仪检测UTI对组蛋白诱导HK-2细胞凋亡的影响。3.Hoechst染色倒置荧光显微镜观察细胞核形态学变化。5.Rhodamine123染色流式细胞仪检测线粒体膜电位(MMP)变化。6.DCFH-DA染色流式细胞仪检测活性氧(ROS)的产生。7.Western blot法测定Bcl-2、Cleaved Casepase-3、LC3Ⅱ、Beclin1 蛋白表达水平.研究结果1.CTH能明显降低HK-2细胞活性,具有浓度、时间依赖性,CTH IC50为64.25ug/ml;不同浓度UTI组(500U/ml、1000U/ml、2000U/ml)对组蛋白诱导的HK-2细胞凋亡率均有保护作用,但组间比较差异无统计学意义;高浓度UTI(2000U)对HK-2细胞活性无明显抑制作用;2.Annexin V FITC/PI双染证实CTH能引起HK-2细胞发生凋亡,而UTI能减少CTH引起的HK-2细胞凋亡(p<0.01)。3.Hoechst染色结果显示:CTH能引起HK-2细胞发生凋亡,细胞核固缩浓染,致密浓染点明显增多;而UTI能减少CTH引起的HK-2细胞凋亡,致密浓染点减少。4.Rhodamine123染色结果显示:CTH能引起HK-2细胞线粒体膜电位下降,而UTI能减弱CTH引起的线粒体膜电位下降。5.DCFH-DA染色发现:CTH能引起HK-2细胞活性氧(ROS)产生增多,而UTI能减弱CTH引起的活性氧生成。6.Western blot法测得:CTH能引起HK-2细胞Cleaved Caspase-3、LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达上升,Bcl-2蛋白表达下降(p<0.05);而UTI能下调CTH引起的LC3Ⅱ、Beclin1、Cleaved Caspase-3蛋白表达上升、上调Bcl-2蛋白表达(p<0.05);研究结论UTI对组蛋白诱导的HK-2细胞损伤起保护作用,其机制可能与维持线粒体膜电位、清除ROS、上调抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达、抑制Caspase-3活化从而抑制细胞凋亡及调节自噬功能相关。