罗汉果中含有12种葫芦烷三萜甙类化合物,其中罗汉果甙V是主要的甜味成分,罗汉果甙V是葫芦烷型四环三萜甙类化合物,其甜度为蔗糖的300倍,热量低,具有润肺镇咳、滑肠通便之功效,对龋齿、肥胖、糖尿病等具有防治作用。它占总甙的30～40%,其余60～70%为其他低甜甙类甚至为无甜甙类,这些甙类没有被利用,因此造成了罗汉果资源的浪费。本文研究了罗汉果采后处理条件,并对罗汉果中的甙类物质提取、纯化,以及利用生物化学方法对罗汉果提取物中的非甙V类物质进行酶法转化条件的研究,最后通过核磁共振等波谱方法对其酶法转化产物进行结构鉴定,以期为充分利用罗汉果资源,提高罗汉果甙V的得率奠定理论基础。研究主要内容及结果如下:1.青罗汉果后熟工艺条件的研究根据罗汉果甜甙的生理积累规律,罗汉果甙V是由罗汉果低甙类随着成熟度的增加转化而来的。因此,进行青罗汉果后熟工艺条件的研究以促进甜甙类物质的转化。以采后青罗汉果为研究对象,本研究主要考察了有无光照、光照时间、恒温及变温等处理方式对采后青罗汉果甙V转化的影响,每个处理随机取6个一组作为平行组,并设置室温下自然放置、始终遮光处理为对照组,以甙V含量为考察指标,通过紫外分光光度法对甙V含量进行检测。根据结果及节约成本等方面考虑,选择出青罗汉果后熟合适的工艺条件为:采后的青罗汉果置于20℃恒温光照箱中,每日光照3～6h共9d,光照强度为1060勒克斯(Lx),甜甙V含量可达到峰值为0.112g/100mL。和初始值相比,提高了约4.71倍。2.罗汉果中的甙类物质提取和纯化本研究以罗汉果干果为原料,按料液比为1:10,使用超声波辅助水提法提取罗汉果甙,将得到的罗汉果甙类粗提液pH调至9.0,然后通过AB-8大孔吸附树脂初步分离其中的甙类成分,依次用去离子水、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇进行梯度洗脱。流速为1mL/min,每一种洗脱剂的洗脱量为3BV,收集各洗脱液,浓缩后通过紫外分光光度法进行检测,并使用薄层层析色谱法(Thin Layer Chromatography,TLC)进行定性分析。结果显示,60%乙醇可将甙V从AB-8大孔吸附树脂上洗脱完全。从而将罗汉果甙V和非甙V成分分离开。3.酶法转化条件的研究对罗汉果提取物中的非甙V类物质(罗汉果甜甙V的初始含量为0.016g/100mL)进行酶法转化条件的研究。采用环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin Glucanotransferase,CGTase)法研究酶转化非甙V类物质的条件,通过单因素实验考察了酶反应的pH值、酶反应底物种类、温度、反应时间、酶与底物的比、料液比等对酶法转化非甙V提高罗汉果甙V的影响程度,由结果筛选出影响程度较大的4个因素进行正交试验,由此得到最佳的酶法转化工艺条件。结果显示,其最佳工艺条件为:在pH 5.5、葡萄糖作为酶反应底物条件下,45℃反应10min,酶(mL)与罗汉果甜甙提取液(mL)比为1:1,料液比[料指底物葡萄糖(g),液指酶液(mL)和罗汉果甜甙提取液(mL)]为1:14,即1g:(7mL+7mL)。采用最佳条件进行验证试验,重复3次,在此条件下,罗汉果甜甙V的含量为0.051g/100mL,与转化前相比最大提高约2.25倍。4.转化产物分离纯化条件的研究及转化产物显色方法的选择采用最佳酶法转化工艺进行转化,获得转化产物。通过紫外分光光度法测定甙V的含量,采用薄层色谱法(Thin Layer Chromatography,TLC)检测加酶前后的结果,研究正丁醇:冰醋酸:水=4:1:1,正丁醇:乙醇:水=5:1:1,氯仿:甲醇:水=60:10:1等3种展开剂对加酶后转化产物的分离效果。结果显示,展开剂为正丁醇:冰醋酸:水=4:1:1时适合转化产物的分离,硅胶板上整体的展开速度适中且酶转化产物的分离度较好。最终获得了 4个分离产物,分别命名为:L1、L2、L3、L4。使用正丁醇:冰醋酸:水=4:1:1作为展开剂进行转化产物的分离,分别比较了紫外显色、碘染显色和10%硫酸乙醇显色等三种显色方法对TLC分离结果的显色情况。根据显色情况,操作简易度、实验安全性来选择较合适的显色方法。结果显示,碘染显色法最佳,便于转化产物的识别。5.转化产物的制备及纯品鉴定采用10×10(cm)硅胶G薄层板,上样10μL成1cm的斑点,采用最佳展开剂正丁醇:冰醋酸:水=4:1:1进行展开,刮出得到4个斑点,然后采用无水乙醇溶解离心取上清液,挥去乙醇,得到4个转化产物的纯品。采用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)对所得的4个转化产物进行纯品鉴定。色谱条件:日本岛津Iner Sustain C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);柱温:40℃;流动相:乙腈-水,梯度洗脱0-20min,乙腈-水(80:20),20min以后,乙腈-水(76:24);检测波长:210nm;体积流量:0.75mL/min;进样量:20μL。时间为 30min。使用软件 Lab Solution version 5.82进行液相色谱分析。结果显示,转化产物在保留时间为12.359min处有明显的出峰,与罗汉果甙V出峰的保留时间一致。说明转化产物中含有罗汉果甙V。6.酶法转化产物的结构鉴定采用核磁共振(NMR)波谱法对获得的4个转化产物进行结构鉴定,最终推断出转化产物L1、L2、L3、L4的化学结构:L1:罗汉果醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(6→1)-24-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(2→1)(mogrol-3-O-β-glucopyranosyl(6→1)-24-O-β-D-glucopyranosyl(2→1)),即罗汉果甙ⅣE;L2 和 L3:罗汉果醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(6→1)-24-O-β-D-吡喃葡萄糖基(6→1)-β-D-吡喃葡萄糖苷(2→1)(mogrol-3-O-β-glucopyranosyl(6→1)-24-O-β-D-glucopyranosyl(6→1)-β-D-glucopyranosyl(2→1))即,罗汉果甙V(Mogroside V);L4:非甙类物质。结果表明,转化产物L1为罗汉果甙ⅣE,L2、L3均为罗汉果甙V,说明采用CGTase法可将罗汉果非甙V类物质转化为甙V。综上所述,依靠采后青罗汉果的后熟处理和酶法转化方法可以提高罗汉果甙V的含量,使罗汉果资源得到了更充分的利用,为提高罗汉果甙V的得率奠定了一定的理论基础。