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目的:肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种对人类生命健康具有重要威胁的疾病,由于起病隐匿并且缺乏准确的早期筛查方法,很多病人初诊时以为晚期,失去了根治性手术机会。随着靶向药物索拉非尼的出现,为晚期肝癌患者带来了新的希望,但大多数患者在用药6个月时会出现索拉非尼耐药,阐明索拉非尼耐药的机制具有重要意义。一些长非编码RNA(Long chain non-coding RNA,Lnc RNA)已被证实对HCC索拉非尼耐药性的发展至关重要。Lnc RNA AK021443(以下简称为AK021443)在本团队之前的研究中证实了其在人肝癌细胞系Huh-7及Hep G2中高表达,并通过正向促进EMT作用调控HCC的发生发展。本研究意在前期实验基础上,进一步探究AK021443对肝癌细胞索拉非尼敏感性的影响以及AK021443与肝癌索拉非尼耐药是否相关及其可能机制,以期为探究HCC索拉非尼耐药提供新的生物学靶点。方法:1.选取Huh-7、Hep G2两组人肝癌细胞系及人宫颈癌细胞Hela,通过不同浓度索拉非尼孵育,测定细胞存活率,确定其IC50值、索拉非尼实验浓度梯度及索拉非尼对肝癌细胞的特异性。2.使用Huh-7构建敲低AK021443的细胞模型,使用Hep G2建立过表达AK021443的细胞模型,不同浓度的索拉非尼孵育细胞,测定细胞存活率,探究AK021443对人肝癌细胞对索拉非尼的敏感性的影响。3.使用Hep G2建立索拉非尼耐药细胞株,在Hep G2索拉非尼耐药细胞系中干扰AK021443,不同浓度的索拉非尼孵育细胞,通过与对照组比较,分析AK021443与索拉非尼耐药的相关性。4.测定Hep G2野生型细胞系、Hep G2索拉非尼耐药细胞系及Hep G2索拉非尼耐药细胞AK021443干扰组中EMT相关蛋白的表达水平,探究AK021443影响肝癌索拉非尼耐药的可能机制。结果:1.加入索拉非尼培养24h后的IC50值:Hep G2为5.0±0.04μM、Huh-7为7.2±0.05μM、He La未检出。2.加入索拉非尼培养24h后干扰AK021443的Huh-7细胞对索拉非尼的药物敏感性要高于对照组细胞,当Huh-7细胞抑制AK021443后,细胞的IC50值为3.94±0.05μM,明显小于对照组(IC50值6.79±0.06μM),并且在2.5μM-20μM的索拉非尼浓度之间,抑制AK021443的Huh-7细胞比对照组有着明显的差异性(P<0.01),药物敏感性高,细胞的存活率更低;反之在过表达AK021443的Hep G2细胞中相较于空载的对照组细胞,对索拉非尼药物的药物敏感性有所降低,过表达AK021443的Hep G2细胞的IC50值为11.25±0.04μM,明显要高于空载的对照组细胞(IC50值6.25±0.05μM),并且在加药浓度5μM~20μM之间,过表达AK021443的Hep G2细胞对索拉非尼的药物耐受程度是高于对照组(P<0.001),药物敏感性低,细胞的存活率更高,曲线差异明显。3.间歇诱导法建立Hep G2耐索拉非尼耐药细胞株,称作Hep G2-DR。Hep G2-DR IC50值为(14.50±0.06)μM,明显高于Hep G2野生型细胞。观察细胞形态,显示Hep G2-DR在形态发生了梭形变化。通过q PCR法检测,发现耐药细胞中的AK021443的表达明显高于野生型细胞(P<0.01)。在Hep G2-DR中干扰AK021443,并于对照组比较,分析两者的IC50分别为(13.97±0.03)(10.45±0.02)μM,干扰AK021443后索拉非尼对耐药细胞的抑制率升高,曲线差异显著(P<0.01)。4.通过Western blot法检测Hep G2野生型细胞与Hep G2-DR相关的EMT指标,结果显示耐药细胞上皮样标志物(E-cadherin)显著下调,间质样标志物(Vimentin,N-cadherin)则明显上调(P<0.01),说明耐药细胞发生了EMT转变。5.在Hep G2-DR中干扰AK021443,通过Western blot检测耐药细胞与干扰组细胞相关的EMT指标,结果显示干扰组上皮样标志物(E-cadherin)显著上调,间质样标志物(Vimentin,N-cadherin)则明显下调(P<0.01),说明在Hep G2-DR中干扰AK021443的表达能够促使细胞发生MET的转变,从而说明了AK021443在肝癌索拉非尼耐药细胞EMT转变中发挥重要作用。结论:1.AK021443影响肝癌细胞对索拉非尼的敏感性,肝癌细胞中AK021443表达越低,对索拉非尼越敏感。2.干扰AK021443可以缓解肝癌细胞索拉非尼耐药。3.AK021443可能通过EMT途径促进肝癌细胞索拉非尼耐药。