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研究背景及目的：原发性肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,每年有超过500万人死于HCC[1,2]。尽管肝细胞肝癌的诊断和治疗都有许多新进展,但是其复发率和转移率却居高不下。因此,深入研究HCC的发生机制、寻求HCC的治疗新靶点仍然是我们面临的重要课题。越来越多的研究表明肿瘤微环境在肝细胞肝癌的生长侵袭和转移中发挥着重要作用。肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages, TAMs)是肿瘤微环境中的重要组成部分,它可以促进HCC的生长和转移。众所周知,巨噬细胞的功能多样、可塑性强,不同的局部组织环境刺激巨噬细胞产生不同功能。巨噬细胞主要有两种类型：经典活化型巨噬细胞(M1)和替代活化型巨噬细胞(M2)。M1主要由LPS或IFN-y诱导,可以分泌IL-12、TNF-α、iNOS等促炎因子,在Thl型免疫应答及抗肿瘤免疫中发挥重要作用；而M2可以由IL-4、IL-13、TGF-β等诱导形成,高表达IL-10、CD206、IL-6及Arg-1等分子,表现为抗炎活性,有很强的组织修复能力及促肿瘤活性。新近研究发现肿瘤细胞可以驯化募集到肿瘤组织中的单核细胞,分化为肿瘤相关巨噬细胞,并分泌IL-10、TGF-β等细胞因子而表现为M2表型。基因表达谱研究证实肝癌组织浸润巨噬细胞中多种M2型相关基因表达明显上调。临床研究发现肿瘤组织中的TAMs数量与病人预后显著相关,TAMs的数量越多,病人的预后越差。因此,阐明TAMs活化机制,揭示促进TAMs替代性活化的关键免疫分子具有重要意义。Tim-3(T-cell immunoglobulin and mucin-domain-containing molecule-3)最初被认为是Thl型细胞的特异性标记。随后的研究发现Tim-3广泛表达于多种免疫细胞,如NK、DC、巨噬细胞等,甚至表达在一些肿瘤细胞上,如宫颈癌、卵巢癌。众多研究证实,Tim-3不仅抑制T细胞介导的免疫反应促进免疫耐受,而且参与肿瘤及慢性病毒性感染中T细胞耗竭的形成。Tim-3与其配体相互作用,在不同固有免疫细胞中发挥不同的免疫调节作用。2007年Science报道,Tim-3高表达于巨噬细胞,并通过NF-κB通路促进巨噬细胞的炎症反应。但Tim-3是否参与巨噬细胞极化的调节,进而影响TAMs的功能并参与肿瘤的发生发展,迄今尚未见报道。本实验室前期发现HCC患者外周血中单核细胞及肿瘤浸润TAMs中Tim-3表达显著升高,提示Tim-3参与TAMs活化及HCC发生发展。本研究拟以HCC为研究对象,探讨肿瘤微环境促进TAMs表达Tim-3,进而调节TAMs功能促进HCC发展的作用及分子机制。方法与结果1.肝癌患者TAMs中Tim-3表达显著升高,且与预后负相关免疫组化及免疫荧光检测肝癌组织芯片中69对肝癌组织及其对应癌旁组织中CD68及Tim-3的表达,结果均显示CD68与Tim-3显著共表达,与癌旁组织相比,癌组织中巨噬细胞上Tim-3的表达显著升高(p=0.0220),生存曲线分析发现CD68+TAMs中Tim-3表达高的肝癌患者生存期较短,预后较差(p<0.001)。2.肿瘤微环境中的TGF-β促进巨噬细胞表达Tim-3及M2-样极化文献显示,肿瘤细胞及其微环境可以驯化TAMS。为研究肿瘤微环境对TAMs中Tim-3表达的调节作用,取对数生长期的鼠肝癌细胞系H22,无血清培养24h后收集上清成为条件性培养基(hepatocellular carcinoma Conditioned Medium, HCM)。条件性培养基刺激新鲜分离的小鼠腹腔巨噬细胞,流式或RT-PCR检测巨噬细胞上Tim-3及巨噬细胞极化相关分子标记的表达。结果显示,HCM显著促进巨噬细胞上Tim-3表达,且呈剂量依赖性和时间依赖性；伴随Tim-3的表达升高,HCM促进巨噬细胞M2相关分子CD206、Arg-1的表达,抑制巨噬细胞中M1相关分子TNF-α表达。提示肿瘤微环境促进巨噬细胞Tim-3表达及巨噬细胞向M2-样极化。肝癌患者外周血及肝癌局部有较高水平的TGF-β。为研究TGF-β对巨噬细胞Tim-3表达及其极化的影响,进行TGF-p阻断实验：腹腔巨噬细胞与TGF-β受体阻断剂SB431542孵育24h(DMSO做对照)后,加入条件性培养基,继续陪养24h。流式、RT-PCR检测相关分子表达。结果显示,SB431542抑制TGF-β的受体后明显抑制HCM介导的巨噬细胞Tim-3表达升高及巨噬细胞M2极化(表现为CD206、IL-10、Arg-1降低)。收集另一种鼠肝癌细胞系Hepa1-6的条件培养基重复上述实验得到了相同结果。与此相对应,10ng/ml的外源性TGF-β可以显著促进巨噬细胞中Tim-3表达。上述结果提示,肿瘤微环境中的TGF-β促进巨噬细胞上Tim-3的表达及巨噬细胞M2极化。H22荷瘤鼠的体内实验结果支持这一假设：与脾脏CD11b+细胞相比,荷瘤鼠肿瘤组织浸润CD11b+中Tim-3表达显著升高。为了进一步验证上述结果,我们收集了健康人和肝细胞肝癌病人的血清,刺激人单核细胞系THP-1。24h后流式检测Tim-3及CD206表达,结果表明与健康对照相比,肝细胞肝癌病人的血清可以显著上调THP-1上Tim-3的表达及其M2-样极化(CD206升高)；而SB431542预处理THP-1,阻断TGF-p后,明显抑制肝癌病人血清介导的THP-1上Tim-3表达升高及巨噬细胞M2极化,提示肿瘤微环境中的TGF-β促进巨噬细胞Tim-3表达及其M2极化。为进一步研究TGF-β调节Tim-3表达的机制。构建了Tim-3启动子的报告质粒,转染鼠的巨噬细胞RAW264.7及人肝癌细胞Huh-7后,分别加入不同浓度TGF-β(Ong、2.5ng、5ng、10ng/mL)刺激,8h后双荧光素酶报告基因分析检测Tim-3的启动子活性。结果显示,TGF-β剂量依赖性促进RAW264.7及Huh-7中的Tim-3启动子活性。提示,TGF-β在转录水平上促进Tim-3的表达。3.肿瘤微环境及TGF-β通过Tim-3促进巨噬细胞极化为了研究Tim-3在肿瘤微环境及TGF-β诱导的巨噬细胞极化中的作用,我们在HCM或TGF-β刺激巨噬细胞前分别用三种方法阻断Tim-3通路。阻断方法如下：Tim-3的阻断性抗体与巨噬细胞共孵育1h(IgG为对照)；合成针对Tim-3的siRNA, Lipo2000转染腹腔巨噬细胞24h(无关序列NC为对照)；表达Tim-3shRNA (shTim-3-Lv)的慢病毒以MOI20感染骨髓诱导的巨噬细胞(空病毒为对照),72后慢病毒干扰效果显现。上述处理的巨噬细胞分别以10ng/mL的TGF-β或适量的条件性培养基刺激24h,ELISA检测IL-10及IL-12表达。结果显示,阻断巨噬细胞上的Tim-3后,HCM或TGF-β刺激的巨噬细胞中IL-12分泌显著升高而IL-10分泌降低。进一步western blot检测阻断Tim-3后巨噬细胞中极化相关转录因子的表达,结果显示阻断Tim-3后巨噬细胞中M1极化相关转录因子STAT-1磷酸化水平升高了而M2相关转录因子STAT-6磷酸化水平降低。上述结果提示,Tim-3参与肿瘤微环境及TGF-β诱导的巨噬细胞极化过程。4.巨噬细胞表达的Tim-3显著促进肝细胞肝癌进展众多文献证实,M2极化的巨噬细胞促进肝癌细胞生长及转移。为了研究Tim-3在其中的作用,我们设计下列体内外实验。4.1干扰巨噬细胞Tim-3表达显著抑制肝癌细胞系的生长及迁移慢病毒感染骨髓诱导的巨噬细胞以干扰Tim-3的表达,72h后加入10ng/ml的IL-4继续培养24h,收集巨噬细胞培养上清与全培养基以1：1的比例混合,刺激小鼠肝癌细胞系Hepal-6,进行生长曲线、集落形成及Transwell实验。结果显示,与对照相比,慢病毒干扰Tim-3后巨噬细胞培养上清刺激Hepal-6细胞的生长及克隆形成能力显著降低(p=0.032)；与此相对应,Transwell实验表明干扰巨噬细胞Tim-3表达明显抑制Hepa1-6的迁移和侵袭能力(p<0.001)。4.2干扰巨噬细胞Tim-3表达显著抑制荷瘤鼠体内H22移植瘤生长肝癌细胞系H22与慢病毒感染Tim-3的巨噬细胞按4：1的比例混合后在BALB/c小鼠腹股沟皮下成瘤,对照慢病毒感染巨噬细胞为对照。裸眼可见后隔天测量瘤体体积,12天后处死称瘤重,并做切片,免疫组化染色增殖指标Ki67。生长曲线及瘤重结果均表明,干扰巨噬细胞Tim-3表达明显抑制移植瘤的生长。免疫组化染色结果显示,干扰巨噬细胞Tim-3组肿瘤中Ki67显著降低,提示肝癌细胞增殖受到抑制。5Tim-3通过NF-κB调控巨噬细胞IL-6表达,促进HCC细胞系生长众所周知,巨噬细胞通过分泌活性细胞因子发挥其功能。鉴于此我们用CBA检测上述生长曲线及克隆形成实验中巨噬细胞上清中的细胞因子,结果显示,干扰Tim-3表达显著抑制了巨噬细胞IL-10、IL-6、GM-CSF的分泌,促进IL-12产生,而IL-1p没有明显变化。IL-6在HCC发生发展中发挥重要作用,其表达NF-κB的调控。文献报道,Tim-3活化EAE小鼠巨噬细胞中的NF-κB通路。因此,我们设计实验研究NF-κB-IL-6在Tim-3介导的巨噬细胞促肿瘤生长中的作用。shTim-3-Lv感染巨噬细胞后,再用IL-4或者TGF-p刺激,收蛋白western blot检钡JNF-κB下游分子p65的活化情况。结果表明干扰巨噬细胞上的Tim-3后无论是加入IL-4还是TGF-β,p65的磷酸化形式都是下降的,与IL-6的变化相一致。进一步干扰掉巨噬细胞上Tim-3的同时抑制NF-κB,加入IL-4或者TGF-β刺激,24h后检测上清中IL-6的水平,ELISA结果表明NF-κB的抑制性配体可以逆转shTim-3-Lv对IL-6的抑制作用。为进一步验证IL-6对肝细胞肝癌的生长作用,我们利用IL-6的阻断性抗体预处理shTim-3-Lv感染巨噬细胞的上清后刺激Hepal-6细胞,72h后检测其生长状况。结果表明阻断IL-6后,shTim-3-Lv介导的巨噬细胞对Hepal-6细胞生长的促进作用消失。我们的上述结果提示,Tim-3通过NF-κB调控IL-6的表达,促进HCC细胞的生长。结论：肝细胞肝癌患者TAMs中Tim-3表达明显升高,且TAM中Tim-3表达与HCC患者预后显著相关；HCC患者肿瘤微环境中的TGF-p在转录水平促进巨噬细胞表达Tim-3,并且促进其M2极化；TAMs中表达升高的Tim-3通过NF-κB促进巨噬细胞IL-6的表达,进而在体内外促进肝细胞肝癌的生长。创新性和意义本研究首次证明了HCC患者肿瘤微环境促进TAMS表达Tim-3的机制及其对肝癌细胞生长的作用,研究结果不仅有助于阐明Tim-3这个免疫分子在抗肿瘤固有免疫中的作用,并且为肝癌的肿瘤免疫性治疗提供了新的思路和治疗靶点.