siRNA (Short interfering RNA, siRNA)干扰技术作为一种新型的基因沉默技术,因其具有高效、高特异性、低毒性等优点,应用siRNA干扰技术开发新型的靶向药物,已成为药物研究领域中重点发展方向之一。近年来,已经证实Argonaute蛋白(Ago蛋白)是RNA诱导基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)中关键的调控蛋白之一,在RNA干扰途径中,参与siRNA的识别、解链以及催化切割mRNA等功能,对靶基因沉默作用起关键调节作用。本论文是针对Ago蛋白与siRNA分子的协同作用机制,基于Ago蛋白的晶体结构,采用计算机辅助设计、荧光素酶活性筛选等研究方法,系统地研究化学修饰位点、修饰单体以及修饰组合与生物活性之间的关系,由此筛选出具有显著基因沉默作用的siRNA化学修饰组合,并且应用该修饰技术,利用前期研究已发现的高特异沉默作用的MDM2-siRNA序列,对化学修饰MDM2-siRNA进行了体外生物活性筛选。由此初步建立新型的siRNA化学修饰技术,并同时获得高特异性、高活性、高稳定性的化学修饰的MDM2-siRNA。—FANA化学修饰位点与生物活性的研究针对Ago蛋白与siRNA协同引起基因沉默作用的特点,选择特异性抑制病毒生长的5种不同靶基因siRNA序列,利用2’-脱氧-2’-氟-b-D-阿拉伯糖核苷酸(2’-Deoxy-2’-fluoro-b-D-arabino nucleic acid, FANA)修饰不改变RNA螺旋构型的技术优点,以该结构作为小分子探针,研究siRNA碱基序列不同化学修饰位点与生物活性之间的关系。生物活性检测结果显示：1. siRNA正义链、反义链3’末端碱基FANA修饰,均能不同程度的降低靶基因沉默作用,其中反义链降低的作用更为显著。2.反义链3’末端以及中间位点的碱基修饰,均容易导致化学修饰siRNA活性降低,尤其反义链中间9-11位碱基的修饰,生物活性作用降低更为显著。3.正义链FANA修饰对基因沉默作用的影响相对较弱,正义链中间位点不同区域片段的碱基修饰,均能在不同程度上影响siRNA的活性,一般修饰后活性强弱顺序如下：D区>C区>B区,其中D区碱基修饰可能会在一定程度上提高基因沉默作用。在本研究中,我们完成了FANA修饰单体的合成工艺探索,同时针对5种不同的靶序列,完成了44个新型化学修饰siRNA的制备,其中Ⅱ-siRNA6、Ⅱ-siRNA11以及Ⅴ-siRNA3对病毒的抑制作用显著,值得进一步评价。二Ago蛋白PAZ区的理论研究基于Ago蛋白PAZ区的晶体结构,设计了X、Y和Z共3种系列的新型化学修饰单体,利用计算机辅助药物设计的方法,预测了PAZ区与3’末端不同化学修饰组合相互之间的结合能,初步推测其与基因沉默作用之间的关系,实验结果显示：1.选择1SI2和1SI3的晶体蛋白进行骨架叠合,二者叠合结果十分理想,PAZ区的结构相对比较保守；以1SI2作为模板,对siRNA与Ago蛋白的作用模式进行结构分析,数据表明siRNA的3’末端碱基可以与PAZ口袋区特异结合,适当引入疏水性基团,有利于两者之间的相互作用。2.选择X、Z系列的修饰单体,利用MacroModel模块,预测和评价了3’末端不同化学修饰组合与Ago蛋白PAZ口袋区结合能量变化的趋势,结果显示,dTX修饰组合总结合能、范德华作用力结合能均最小。3.利用计算机辅助设计中分子叠合的方法,初步预测和评价了3’末端不同的修饰组合与Ago蛋白PAZ口袋区结合后立体构型的变化状态,实验结果表明,相对于未修饰dTdT组合,dTX修饰组合立体构型基本保持不变,第2位疏水性基团替代嘧啶类结构,有助于芳香性疏水片段与PAZ区疏水性氨基酸残基,通过弱的范德华作用产生静电结合。4.新型修饰单体的化学结构,活性结合位点取代基团的电负性,以及结合作用模式等,均影响总结合能的变化,引入疏水片段能显著降低总结合能；dTX修饰组合在空间结构上与dTdT组合基本保持一致,芳香性疏水片段替代碱基更有助于降低siRNA的3’末端与PAZ区的结合能；推测dTX修饰组合将极有可能起到增强基因沉默作用的效果。三末端修饰siRNA的研究设计并合成了X、Y和Z共3种系列的新型化学修饰单体。基于荧光素酶稳定表达的HepG2/PGL4细胞,选择X系列的修饰单体,采用双荧光素酶的筛选方法,对化学修饰的siRNA进行了体外生物活性的筛选,实验结果显示：1.相对于未修饰siRNA,化学修饰siRNA在500 nM给药剂量下,未发现明显的细胞毒性,表现出比未修饰siRNA更低的细胞毒性。2.dTX修饰的反义链与不同修饰的正义链交叉组合,制备获得新型化学修饰siRNAs,均能明显增强对靶基因的沉默作用。3.3’末端siRNA的化学修饰,能显著改变siRNA的基因沉默作用,说明PAZ区与siRNA的特异识别,在基因沉默作用中可能起关键的调节作用,3’末端的碱基是siRNA关键的修饰位点。4.通过生物活性的筛选,初步发现修饰组合为XdT/dTX、dTX/dTX(正义链/反义链),能显著增强siRNA的基因沉默作用。四化学修饰MDM2-siRNA的研究采用具有显著增强基因沉默作用的化学修饰组合,完成了不同化学修饰MDM2-siRNA的设计、合成以及生物活性、生物稳定性的研究,实验结果显示：1.前期筛选获得的XdT/dTX、dTX/dTX、以及dTX/XX等化学修饰组合,能显著增强siRNA对肿瘤细胞MDM2的基因沉默作用。2.不同化学修饰组合的siRNA与未修饰siRNA相比,能不同程度地提高siRNA的稳定性,其中dTX/dTX修饰组合稳定性优于其他修饰组合。3.筛选获得的Ⅶ-siRNA6相对未修饰siRNA,能明显提高基因沉默作用、稳定性、以及体外抗肿瘤活性,其活性作用分别提高约为2、2和3倍左右,Ⅶ-siRNA6可以作为较好的候选化合物,进行更深入的筛选和评价研究。以上实验结果表明：反义链C区、正义链B区的碱基与Ago蛋白协同作用,参与siRNA的解链和切割的过程,这些位点FANA修饰,容易阻碍Ago蛋白对siRNA的催化解链功能,从而显著降低修饰后siRNA的基因沉默作用；3’末端引入不同的化学修饰基团,能显著影响siRNA与Ago蛋白结合和解离的能力,反义链3’末端化学修饰单体或修饰组合的改变,对基因沉默作用的保留或提高起关键作用。基于siRNA的3’末端与Ago蛋白特异结合的分子作用机制,通过Ago蛋白的理论研究和生物活性筛选的研究,初步证实理论计算的结合能与生物活性存在一定的联系,利用结合能、结合模式的评估,可以在总体趋势上较好的预测修饰组合与生物活性之间潜在的规律；此外,应用理论计算结果虚拟筛选获得的几种修饰组合,在不同靶序列的筛选上均能显著提高基因沉默作用,该修饰组合技术具有一定的通用性；dTX/dTX化学修饰组合,能显著提高MDM2-siRNA的基因沉默作用、体外生物稳定性、以及体外抗肿瘤活性,达到了我们课题的设计目标,同时也为新型化学修饰单体的设计、合成以及结构改造提供了有益的启示。