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抗寒是许多蔬菜和大田作物需要的一个重要农艺性状。利用导入冷应答转录因子基因（CBF）来从转录水平上促进植物自身的大量冷诱导基因表达，并结合导入1～2个高效抗寒基因的策略，是当前植物抗寒遗传改良的基本方向，可能成为有效改善植物抗寒性的重要途径。 本实验从探讨冷旱应答启动子P-RD29A冷诱导活性及冷诱导转录因子CBF3在常温下和低温下超表达时对转基因植株表型及抗寒性的影响等三个方面考虑，构建了相关抗寒基因的三个植物表达载体。通过将携有RD29A-GUS-Tnos基因表达盒的载体pBIN+-RD29A-GUS转化黄瓜和小番茄外植体材料，检测GUS基因的瞬间表达活性，初步探讨了冷诱导启动子P-RD29A在这两种作物中是否具有冷诱导活性的问题。将植物表达载体pBIN+-35S-CBF3对黄瓜和小番茄进行遗传转化，建立了黄瓜高频再生和遗传转化体系，获得了一株转基因黄瓜植株，并通过了植物基因组PCR检测；获得了两个具有Kan抗性的小番茄再生绿芽。主要研究结果如下： 1 冷诱导基因RD29A启动子片段P-RD29A的克隆、序列测定及分析 根据拟南芥菜RD29A基因启动子两端序列设计两个特异引物P1（5’-ctgcaagaatctcaaacacg-3’）和P2（5’-tccaatagaagtaatcaaacc-3’），采用高保真的pfu-DNA聚合酶，从拟南芥（Arabidopsis thaliana）Columbia生态型基因组DNA中，通过PCR扩增出目的片段。纯化的目标产物经Taq DNA聚合酶加A碱基后，采用TA Clonging方法克隆到pUCm-T载体中，得到重组质粒pP-RD29A，转化大肠杆菌XL1-Blue，挑选白色的重组子菌落进行Colony PCR筛选和质粒的酶切验证。挑选有插入P-RD29A启动子片段的重组子单菌落，委托上海博亚生物工程有限公司测序。结果表明，该目的片段为890bp，与发表的拟南芥菜P-RD29A（D13044）相应序列一致。 2 转录因子CBF3基因的克隆、序列测定和分析 根据已发表的拟南芥转录因子CBF3基因序列设计两个特异性引物P3（5’-agcaaaccataccaacaaaaa-3’）和P4（5’-gtactaaaaatggaaataataatctgag-3’），采用与P-RD29A相同的方法进行克隆、序列测定和分析。获得的重组质粒命名为pCBF3，委托上海生工生物工程有限公司测序。结果表明，所克隆的目的片段为760bp，编码216个氨基酸，与发表的拟南芥菜CBF3基因（AF076155）相应序列及编码的氨基酸一致。 3 植物表达载体的构建 质粒pP-RD29A经PstI+BamHI双酶切后回收P-RD29A启动子，替换质粒pSAU2006中的CaMV 35S启动子，建成携带RD29A-GUS-Tnos基因表达盒的中间载体pRD29A-GUS。pRD29A-GUS经SmaI+Ecl136双酶切后，回收大片段，平端线型DNA自环化，构建成携带RD29A一Tnos基因片段的中间载体 pVCT20ll。质粒 pCBF3经 Bgllll 单酶切后获得的目的基因片段 CBs正确的插入到 PVCT2011经 Bwhl单酶切后的线型载体中，构建成携带有RD29A－CBF3－Tnos基因表达盒的中间载体pVCT2012。质粒pSAU2006经Bwhl＋Hjndlll双酶切后回收 C洲 355 启动子，pVCT2012经 BglIll＋HjI7dlll双酶切后回收大片段，两片段经连接构建成携有355－CBF3－Tnos基因表达盒的中间载体pVCT2014。 质粒 nBINPLUS经 Ecdil＋Hindlll双酶切后回收大片段。质粒nRD29A－GUS、nVCT2012和 pVCT2014分别经 Ecdil＋Hjndlll双酶切后回收目的基因表达盒片段 RD29A－GUS－Tnos、RD29A－CBF3－Tnos和355－CBF3－Tnos，然后分别连接至线型pBINPLUS载体上，构建成植物表达载体出I卜RD29A－GUS、pBIN二RD29A－CBF3和咄I卜355－CBF3。4 冷诱导启动子PRD29A在黄瓜和小番茄中的冷诱导表达特性” 以1天龄的黄瓜子叶和小番茄试管苗真叶为无菌外植体材料，分别经活化的农杆菌LBA4404（PBIN乙RD29AAIUS＋PAL4404）菌液浸染后，暗培养32个小时，分另经5’C＊温诱导和 25oC常温处理后组织化学染色。结果表明，冷诱导启动子P－RD29A在黄瓜和小番茄中均具有冷诱导活性，受SC的低温诱导表达，而在25oC常温下不表达。5 植物表达载体 PB N＋35S七BF3对黄瓜的遗传转化研究 以1天龄的黄瓜子叶为外植体，以MS为基本培养基，通过加入不同浓度组合的BA和NAA，筛选到了试管苗生长最适培养基（l／ZMS附加 3％蔗糖的固体培养基）和根生长最适培养基（l／ZMS附加 0．sgg／L NAA的液体培养基）。 在最适培养基上研究了黄瓜子叶外植体对卡那霉素的敏感性、预培养天数、共培养时间及感菌时间等因素的影响，建立了黄瓜高频转基因再生体系，即取1天龄的黄瓜无菌子叶在芽分化培养基MSK（MS＋ling／L BA＋ling／L ABA＋Zing／L AgN03的固体培养基）上预培养二～2天，投入到活化的农杆菌 LBA4404（PBIN”－355－CBF3＋PAL4404）菌液中浸染 10分钟，在MSK培养基上暗培养 2～4天，在附加 300mg／L Carb的MSK培养基上延迟培养一周后，转入筛选培养基（MSK＋90mg／L Kan＋200mg／L Carb）中筛选抗性愈伤和抗性芽，每两周更换一次培养基，抗性芽转入试管苗生长培养基中培养1～2周，然后转入生根培养基中诱导生根，从而获得具有Kan抗性的黄瓜转基因再生苗。共获得4株转基因再生植株。取植株叶片用CTAB法