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第一部分HBV RNase H活性位点氨基酸变异对HBV复制的影响摘要目的:探讨HBV RNase H结构域区活性位点关键氨基酸及其变异对病毒复制的影响。方法:采用计算机软件对HBV (adw2), DHBV、Heron HBV(苍鹭HBV)和WHV(土拨鼠HBV)四种病毒的RNase H区域的氨基酸序列进行比较,并参考HIV、大肠杆菌RNase H活性位点D-E-D-D motif结构,采用Mega-PCR (Mega-primer PCR,大引物法PCR)将HBV (adw2) RNase H序列第D702、H728、E731和D790位氨基酸定向突变,构建了D702A、H728V、E731A和D790A 4个RNase H突变体的表达质粒。将构建的RNase H突变体、阳性对照D750V(RNase H功能缺陷)、阴性对照pCMV-HBV-LE-(RNase H功能正常)表达质粒分别转染Huh7细胞,转染后第5天从细胞胞浆中回收病毒颗粒、提取病毒核酸。为明确病毒颗粒中核酸组分,各样本取2等份,其中一份加RNase H(来自于大肠杆菌),另一份不加RNase H,进行体外消化,然后对样本作Southern分析。结果:Southern分析显示,在转染细胞中, RNase H突变体D702A、E731A、D790A和阳性对照D750V由于RNase H活性下降或缺失,导致HBV DNA复制过程中产生的RNA:DNA杂交体无法被切除,影响了HBV DNA复制,而H728V突变体RNase H活性正常,HBV DNA复制未受影响。结论:HBV RNase H结构域区酶活性位点关键氨基酸也呈D-E-D-D的motif结构,第二部分HBV RNase H引物套区氨基酸变异对病毒复制的影响摘要目的:为了解HBV是否与HIV一样,在其RNase H结构域区酶活性位点附近存在由一系列氨基酸组成的引物套区,以及该区域氨基酸的变异对病毒复制的影响。方法:通过对耐盐芽孢杆菌、HIV和大肠杆菌三种RNases H.序列比对,参照HIV RNase H引物套区氨基酸的组成,围绕HBV RNase H活性位点D-E-D-D结构,选取以下10个位点R718、T729、S742、T749、S756、R757、K758、S761、S793和R796的氨基酸进行定向突变,其中把4个带正电荷氨基酸R(精氨酸)和K(赖氨酸)分别定向突变为带负电荷氨基酸D(天冬氨酸),构建了R718D、R757D、K758D和R796D RNase H突变体表达质粒,对其余6个位点的氨基酸则均定向突变为丙氨酸(A),即丙氨酸扫描诱变法(Alanine-scanning mutations),构建了T729A、S742A、T749A、S756A、S761A和S793A 6个RNase H突变体,将上述10个RNase H突变体装入HBV表达质粒pCMV-HBV-LE-。将构建成功的RNase H突变体、阳性对照D750V(RNase H功能缺陷)、阴性对照pCMV-HBV-LE-(RNase H功能正常)表达质粒分别转染Huh7细胞,转染后第5天从细胞胞浆中回收病毒DNA,通过Southern分析,观察细胞内病毒颗粒中核酸组分的变化,间接了解HBV RNase H活性位点周围区域氨基酸的变异对病毒复制的影响。结果:4个带正电荷氨基酸突变为带负电荷氨基酸后,K758D和R796D两个突变体的多聚酶功能有不同程度的缺陷,尤其前者几乎无功能。而采用丙氨酸扫描诱变法定向突变为丙氨酸的6个RNase H突变体中唯有S793A显示出其RNase H功能缺陷,其余5个突变体显示其RNase H功能正常。结论:在HBV RNase H结构域活性位点邻近区域存在一些氨基酸,尤其是带阳性电荷的氨基酸或某一些极性氨基酸,这些氨基酸构成了所谓的HBV RNase H引物套区,该区域氨基酸的变异可导致RNase H活性缺陷和聚合酶活性下降或消失,间接或直接影响病毒复制。目的:研究和探讨HCV准种特性对抗HCV治疗的影响及意义。方法:189例接受派罗欣+利巴韦林联合抗病毒治疗的HCV基因1型患者,在抗病毒治疗早期的多个时间点包括基线、第4周、第8周和第12周采集血清样本。本研究选择基线和治疗第12周,HCV载量>1000 copies/ml,153例共263份血清样本(其中110例患者有两个时间点样本,43例患者仅有基线样本)进行分子克隆共获取了4314个含超变区1(HVR1)病毒克隆,通过测序对HCV HVR1进行了详细的遗传学分析包括遗传复杂性和遗传多样性。结果:153例患者中104例(68%)达到了早期病毒学应答;抗病毒治疗前有关遗传多样性的指标d、dS和dN,EVR组均高于非EVR组,但只有HVR1 dN达到了统计学差异(p=0.039);同样,抗病毒治疗前EVR组的遗传复杂性在核苷酸或氨基酸水平上,均要高于非EVR组,且在氨基酸水平上达到统计学差异(p=0.0499);本组研究对象中,其体内的HCV准种呈指数分布模式,大部分病人(63%)准种遗传距离小于0.2,遗传距离位于衰减区(d>0.53)的这组病人有更高的早期病毒学应答率(89.5%),这充分说明基线准种多样性与早期病毒学应答之间的关系。结论:早期病毒学应答与HCV准种差异性(多样性和复杂性)相关,即准种差异性大,早期病Objective: To obtain a comprehensive understanding of the role of HCV QS in antiviral therapy. Methods: 189 patients were treated with peginterferon alpha-2a and are the subjects in present study. Patient recruitment was restricted to HCV genotype