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中枢神经系统白血病(central nervous system leukemia，CNSL)是白血病细胞浸润脑和脊髓的总称。CNSL是白血病的一种严重并发症，常常导致治疗失败或预后不良。在急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)中，CNSL的发病率超过25%且CNSL是导致ALL完全缓解后复发的主要原因。目前，CNSL治疗存在三大难点：(1)发病机制不完全清楚；(2)现有的诊断方法有一定的局限性，不能实现早期诊断；(3)早期的预防性鞘内注射化疗药物会导致严重的副作用，包括认知缺陷，内分泌失调和生长障碍。因此，需要寻找CNSL发病早期的生物标志物并阐明CNSL的发病机制，以满足CNSL的早期诊断和个性化精确治疗的要求。
脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)是中枢神经系统的分泌产物，填充于脑室、蛛网膜下腔和脊柱之间。CSF由33类代谢物组成，主要包括糖类、氨基酸类、无机盐和有机酸。由于CSF的代谢物组成与中枢神经系统的新陈代谢直接相关，因此脑脊液的代谢物分析可以为包括CNSL在内的多种中枢神经系统疾病的发生发展提供独特的研究方法。同时，CSF中的代谢物种类多，成分复杂，有必要针对这种多成分的复杂生物样本建立一种高效灵敏的检测方法。
代谢组学是系统生物学的一个重要分支，其通过对生物样本中所有内源性小分子代谢物(小于1500Da)进行定性和定量分析，研究代谢物和代谢通路的改变，从而揭示疾病的病理生理变化和发病机制。目前，代谢组学已经成功应用于疾病的早期诊断、病情分析和发病机制研究中。本课题基于建立的脑脊液代谢组学分析方法，整体表征了ALL合并CNSL脑脊液的代谢变化，从代谢的角度阐明CNSL的发病机制并寻找生物标志物用于CNSL的早期诊断。此外，我们对CNSL的小鼠血浆进行了多组学分析，以揭示CNSL的发病机制，寻找对CNSL进行早期预警的血浆生物标志物。本课题主要包含以下三个方面：
1、基于UPLC/MS的脑脊液代谢组学分析方法的建立
代谢组学的分析步骤主要包括：样本前处理，代谢组学数据采集和代谢组学数据分析。其中，样本前处理在代谢组学分析中起着重要作用，对后续的代谢组学数据采集和数据分析有重要影响。脑脊液是是中枢神经系统的分泌产物，它与许多疾病特别是中枢神经系统疾病的发生发展密切相关。同时，脑脊液中的代谢物种类多，成分复杂。因此，有必要建立一种高效灵敏的方法对脑脊液中的代谢物进行检测。本研究将脑脊液分别用9种不同的蛋白沉淀溶剂和5种不同的复溶剂进行处理，基于检测出的潜在代谢物数量、数据的稳定性(代谢物的相对标准差分布)和重现性(平均欧式距离)，建立了亲水性和反相超高效液相色谱质谱联用分析前的最有效的样本前处理方法。结果表明，以乙醇或甲醇-乙醇-乙腈(1∶1∶1,v/v/v)为蛋白沉淀剂，以水-甲醇-乙腈(2∶1∶1,v/v/v)为复溶剂是反相色谱柱分析时脑脊液较好的前处理方法。以乙醇为蛋白沉淀剂，以水-甲醇-乙腈(2∶1∶1,v/v/v)为复溶剂时，检测出684个代谢物特征峰，其中相对标准差小于0.3的数量为669个，平均欧式距离为0.09，方法的稳定性和重现性均显著优于其它前处理方法；亲水性色谱柱分析时，使用乙醇沉淀蛋白，水-甲醇-乙腈(2∶1∶1,v/v/v)复溶或使用甲醇沉淀蛋白，5%乙腈复溶效果较好。使用甲醇沉淀蛋白，5%乙腈复溶时，检测出340个代谢物特征峰，其中相对标准差小于0.3的数量为339个，平均欧式距离为5.22，方法的稳定性和重现性较好。这一优化的前处理方法为脑脊液非靶向代谢组学研究提供了更好的蛋白沉淀剂和复溶剂选择，将促进中枢神经系统疾病的全面认识。
2、基于脑脊液代谢组学筛选中枢神经系统白血病早期诊断的生物标志物并构建早期诊断模型
CNSL是ALL患者的一种严重并发症，常常导致治疗失败或预后不良。目前，CNSL的发病机制尚不清楚，并且缺乏可靠的早期诊断CNSL的生物标志物。基于之前建立的脑脊液代谢组学分析方法，我们进行了一项脑脊液非靶向代谢组学研究，以寻找在两个独立的ALL队列中能够早期区分CNSL和无CNSL患者的生物标志物。此外，我们还追踪了CNSL患者在CNSL发病前、CNSL时和治疗缓解后等不同阶段中生物标志物的变化。在CNSL患者的脑脊液中我们鉴定出33个显著改变的代谢产物，主要与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，酮体的合成和降解，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，苯丙氨酸代谢，柠檬酸循环，酪氨酸代谢，精氨酸生物合成和丁酸代谢有关。然后，基于香草二醇、酪氨酸、乳酸、丙酮酸和(R)-3-羟基丁酸这五个生物标志物，我们构建了CNSL评分(CNSL evaluation score，CES)模型对CNSL的发病风险进行预测，该评分体系在训练集和验证集的预测准确度分别是97.2%和86.1%。最后，我们通过追踪CNSL患者在不同阶段的CES变化进一步验证CES的准确性，结果表明CES可以很好地监测CNSL的发展。总之，我们的结果表明脑脊液的代谢变化与CNSL密切有关，构建的CES评分模型可以很好地实现CNSL早期预测。这种独特的脑脊液代谢组学研究有助于我们了解CNSL的发病机制并实现CNSL的早期诊断。
3、基于多组学分析的小鼠中枢神经系统白血病的发病机制研究
随着化疗方案的改进和新药的应用，ALL的五年生存率逐步提高，但仍有许多患者在完全缓解后复发，合并CNSL是最主要的原因。然而，CNSL的发病机制尚不明确。本研究试图通过代谢组学和转录组学分析揭示CNSL的发病机制。首先，将急性淋巴细胞白血病细胞NALM-6通过尾静脉注射入非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷(Nonobese diabetic/severe combined immunodeficient，NOD/SCID)小鼠体内，并收集不同时期的小鼠血浆样本。然后将发生CNSL与未发生CNSL的小鼠血浆进行代谢组学和转录组学分析，寻找两者之间的显著性差异代谢物、mRNA和基因。代谢组学分析发现了52个发生CNSL后显著改变的代谢物，通过代谢通路富集分析发现其主要与三羧酸循环，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，甘油磷脂代谢，谷氨酸与谷氨酰胺代谢，精氨酸生物合成，牛磺酸与亚牛磺酸代谢和组氨酸代谢这7条代谢通路密切相关。转录组学分析发现与未发生CNSL的小鼠相比，CNSL小鼠有927个基因水平显著性升高，1474个基因水平显著性降低。通过代谢通路富集分析发现，CNSL主要与鞘脂类代谢，肿瘤坏死因子信号通路，血管内皮生长因子信号通路，三羧酸循环，甘油磷脂代谢，精氨酸生物合成和牛磺酸与亚牛磺酸代谢相关。结合代谢组学与转录组学分析结果，发现CNSL与三羧酸循环，甘油磷脂代谢，精氨酸生物合成和牛磺酸与亚牛磺酸代谢密切相关。同时，我们追踪了这4条代谢通路中显著差异代谢物的含量变化。结果发现10个小分子代谢物的含量在发生CNSL前一周显著提高，中枢浸润后含量更高，它们可以用于CNSL的早期诊断与预警。
本课题通过建立的脑脊液样本代谢组学分析方法、代谢组学和转录组学分析，结合多元统计分析，揭示了早期CNSL的血浆和脑脊液的代谢改变，建立了CNSL的早期预测模型，并探索了CNSL的发病机制。总之，这项研究为CNSL的早期诊断和机制研究提供了新思路。
脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)是中枢神经系统的分泌产物，填充于脑室、蛛网膜下腔和脊柱之间。CSF由33类代谢物组成，主要包括糖类、氨基酸类、无机盐和有机酸。由于CSF的代谢物组成与中枢神经系统的新陈代谢直接相关，因此脑脊液的代谢物分析可以为包括CNSL在内的多种中枢神经系统疾病的发生发展提供独特的研究方法。同时，CSF中的代谢物种类多，成分复杂，有必要针对这种多成分的复杂生物样本建立一种高效灵敏的检测方法。
代谢组学是系统生物学的一个重要分支，其通过对生物样本中所有内源性小分子代谢物(小于1500Da)进行定性和定量分析，研究代谢物和代谢通路的改变，从而揭示疾病的病理生理变化和发病机制。目前，代谢组学已经成功应用于疾病的早期诊断、病情分析和发病机制研究中。本课题基于建立的脑脊液代谢组学分析方法，整体表征了ALL合并CNSL脑脊液的代谢变化，从代谢的角度阐明CNSL的发病机制并寻找生物标志物用于CNSL的早期诊断。此外，我们对CNSL的小鼠血浆进行了多组学分析，以揭示CNSL的发病机制，寻找对CNSL进行早期预警的血浆生物标志物。本课题主要包含以下三个方面：
1、基于UPLC/MS的脑脊液代谢组学分析方法的建立
代谢组学的分析步骤主要包括：样本前处理，代谢组学数据采集和代谢组学数据分析。其中，样本前处理在代谢组学分析中起着重要作用，对后续的代谢组学数据采集和数据分析有重要影响。脑脊液是是中枢神经系统的分泌产物，它与许多疾病特别是中枢神经系统疾病的发生发展密切相关。同时，脑脊液中的代谢物种类多，成分复杂。因此，有必要建立一种高效灵敏的方法对脑脊液中的代谢物进行检测。本研究将脑脊液分别用9种不同的蛋白沉淀溶剂和5种不同的复溶剂进行处理，基于检测出的潜在代谢物数量、数据的稳定性(代谢物的相对标准差分布)和重现性(平均欧式距离)，建立了亲水性和反相超高效液相色谱质谱联用分析前的最有效的样本前处理方法。结果表明，以乙醇或甲醇-乙醇-乙腈(1∶1∶1,v/v/v)为蛋白沉淀剂，以水-甲醇-乙腈(2∶1∶1,v/v/v)为复溶剂是反相色谱柱分析时脑脊液较好的前处理方法。以乙醇为蛋白沉淀剂，以水-甲醇-乙腈(2∶1∶1,v/v/v)为复溶剂时，检测出684个代谢物特征峰，其中相对标准差小于0.3的数量为669个，平均欧式距离为0.09，方法的稳定性和重现性均显著优于其它前处理方法；亲水性色谱柱分析时，使用乙醇沉淀蛋白，水-甲醇-乙腈(2∶1∶1,v/v/v)复溶或使用甲醇沉淀蛋白，5%乙腈复溶效果较好。使用甲醇沉淀蛋白，5%乙腈复溶时，检测出340个代谢物特征峰，其中相对标准差小于0.3的数量为339个，平均欧式距离为5.22，方法的稳定性和重现性较好。这一优化的前处理方法为脑脊液非靶向代谢组学研究提供了更好的蛋白沉淀剂和复溶剂选择，将促进中枢神经系统疾病的全面认识。
2、基于脑脊液代谢组学筛选中枢神经系统白血病早期诊断的生物标志物并构建早期诊断模型
CNSL是ALL患者的一种严重并发症，常常导致治疗失败或预后不良。目前，CNSL的发病机制尚不清楚，并且缺乏可靠的早期诊断CNSL的生物标志物。基于之前建立的脑脊液代谢组学分析方法，我们进行了一项脑脊液非靶向代谢组学研究，以寻找在两个独立的ALL队列中能够早期区分CNSL和无CNSL患者的生物标志物。此外，我们还追踪了CNSL患者在CNSL发病前、CNSL时和治疗缓解后等不同阶段中生物标志物的变化。在CNSL患者的脑脊液中我们鉴定出33个显著改变的代谢产物，主要与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，酮体的合成和降解，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，苯丙氨酸代谢，柠檬酸循环，酪氨酸代谢，精氨酸生物合成和丁酸代谢有关。然后，基于香草二醇、酪氨酸、乳酸、丙酮酸和(R)-3-羟基丁酸这五个生物标志物，我们构建了CNSL评分(CNSL evaluation score，CES)模型对CNSL的发病风险进行预测，该评分体系在训练集和验证集的预测准确度分别是97.2%和86.1%。最后，我们通过追踪CNSL患者在不同阶段的CES变化进一步验证CES的准确性，结果表明CES可以很好地监测CNSL的发展。总之，我们的结果表明脑脊液的代谢变化与CNSL密切有关，构建的CES评分模型可以很好地实现CNSL早期预测。这种独特的脑脊液代谢组学研究有助于我们了解CNSL的发病机制并实现CNSL的早期诊断。
3、基于多组学分析的小鼠中枢神经系统白血病的发病机制研究
随着化疗方案的改进和新药的应用，ALL的五年生存率逐步提高，但仍有许多患者在完全缓解后复发，合并CNSL是最主要的原因。然而，CNSL的发病机制尚不明确。本研究试图通过代谢组学和转录组学分析揭示CNSL的发病机制。首先，将急性淋巴细胞白血病细胞NALM-6通过尾静脉注射入非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷(Nonobese diabetic/severe combined immunodeficient，NOD/SCID)小鼠体内，并收集不同时期的小鼠血浆样本。然后将发生CNSL与未发生CNSL的小鼠血浆进行代谢组学和转录组学分析，寻找两者之间的显著性差异代谢物、mRNA和基因。代谢组学分析发现了52个发生CNSL后显著改变的代谢物，通过代谢通路富集分析发现其主要与三羧酸循环，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，甘油磷脂代谢，谷氨酸与谷氨酰胺代谢，精氨酸生物合成，牛磺酸与亚牛磺酸代谢和组氨酸代谢这7条代谢通路密切相关。转录组学分析发现与未发生CNSL的小鼠相比，CNSL小鼠有927个基因水平显著性升高，1474个基因水平显著性降低。通过代谢通路富集分析发现，CNSL主要与鞘脂类代谢，肿瘤坏死因子信号通路，血管内皮生长因子信号通路，三羧酸循环，甘油磷脂代谢，精氨酸生物合成和牛磺酸与亚牛磺酸代谢相关。结合代谢组学与转录组学分析结果，发现CNSL与三羧酸循环，甘油磷脂代谢，精氨酸生物合成和牛磺酸与亚牛磺酸代谢密切相关。同时，我们追踪了这4条代谢通路中显著差异代谢物的含量变化。结果发现10个小分子代谢物的含量在发生CNSL前一周显著提高，中枢浸润后含量更高，它们可以用于CNSL的早期诊断与预警。
本课题通过建立的脑脊液样本代谢组学分析方法、代谢组学和转录组学分析，结合多元统计分析，揭示了早期CNSL的血浆和脑脊液的代谢改变，建立了CNSL的早期预测模型，并探索了CNSL的发病机制。总之，这项研究为CNSL的早期诊断和机制研究提供了新思路。