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利用转基因动物生产功能性蛋白是目前生命科学领域中的研究热点,与哺乳动物乳腺生物反应器相比,鸡输卵管生物反应器具有明显的优点。胰岛素是胰脏中胰岛β细胞分泌的一种蛋白质激素,是维持血糖在正常水平的主要激素之一,也是治疗I型糖尿病的首选药物。
本实验首先从鸡胸肌中提取基因组DNA,根据已报道的鸡卵清蛋白基因5调控序列设计特异性引物,利用PCR的方法扩增获得了1.2kb DNA片段,克隆到pGEM T-Vector后,经酶切和序列测定证实,此片段即为鸡卵清蛋白基因5调控序列。分析发现,该片段除具有真核启动子结构特征外,还保留了全部组织特异性表达所需的调控元件。
随后将此1.2kb的DNA片段克隆到真核表达载体pVAX1上,替换原有的CMV启动子,再将含有第一内含子的经过改造的人胰岛素基因组基因连接到其下游,经酶切及测序鉴定证明,我们成功地构建了人胰岛素基因输卵管定位表达载体pOV-ImINS。
选取相同日龄海兰褐母鸡8只,通过卵巢注射法将上述输卵管特异性表达载体注射入这些母鸡卵巢中,将其与正常公鸡合笼后,收集每只母鸡所产蛋,对所采集的鸡蛋40枚进行孵化,共获得G1代子鸡21只。用所设计的一对PCR引物P1P2,扩增约800bp的胰岛素基因片段进行检测,结果共有11只为阳性,阳性率为52.3%。为建立人胰岛素转基因鸡生物反应器奠定了基础。