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旋毛虫病是一种世界性分布的人畜共患寄生虫病,人和动物通过摄取生的或未煮熟的含旋毛虫包囊的肉品而感染,人感染后会产生腹痛、腹泻,肌肉疼痛,眼睑浮肿,低烧等临床症状,给人类健康带来巨大威胁,因此,建立旋毛虫病快速诊断技术具有重要的意义。目前,我国动物旋毛虫病的检疫主要使用镜检法和消化法,具有操作简便等优点,但需要检疫者具有很好的专业知识和经验,而且工作人员的劳动强度大;此外,肉品感染强度较低时容易出现漏检。PCR诊断技术大大提高了检验检疫方法的敏感性,然而因PCR仪价格高等因素,该方法的应用受到很大限制。本文通过环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)来建立一种快速、敏感、特异、实用的检测方法,并且将其应用于肉制品中旋毛虫的检测。1.提取旋毛虫肌幼虫基因组DNA,利用PCR技术扩增介于核糖体DNA 18s和28s之间的转录间隔区(internal transcribed spacer 2,ITS2)基因,用于LAMP检测方法的建立和应用。2.针对ITS2基因,设计LAMP引物,进行LAMP扩增,扩增产物的电泳结果和可视化SYBRGreenⅠ荧光染料颜色的变化均表明该LAMP检测方法已成功建立。将旋毛虫DNA进行10倍倍比稀释,以其为模板,分别进行LAMP和PCR检测,结果发现这两种方法的最低检测量分别是模板DNA稀释到109和1012数量级,表明LAMP方法的敏感性是普通PCR的1000倍。将相同重量的小鼠肌肉(无旋毛虫感染)中分别加入不同数量的肌幼虫作为模拟样品,提取DNA分别进行LAMP检测,结果发现2克肌肉样品中仅含有1条肌幼虫亦能检测出来,该实验进行了3次重复,其结果具有很好的稳定性。分别将旋毛虫、弓形虫、捻转血矛线虫、艾美尔球虫、猪囊虫、大肠杆菌等病原的基因组作为模板进行LAMP检测,结果显示只有以旋毛虫基因组为模板所进行的LAMP检测才出现阶梯型的电泳条带并且其SYBRGreen Ⅰ荧光染料呈现荧光绿色,说明该LAMP检测方法具有较好的特异性。3.对猪舌、鸭舌、鸡舌、羊舌和牛舌共110份样品分别提取DNA,采用LAMP方法进行检测。结果发现所有样品均没有阶梯型条带出现,并且可视化判定也没有出现荧光绿的颜色。说明市售肉制品没有受到旋毛虫感染,可以安全食用。本文建立了旋毛虫LAMP检测方法,因其具有不需要PCR仪等精密实验仪器、检测成本较低、操作方便、耗时短、敏感性高、特异性强等优点,在临床旋毛虫病的诊断和肉品检验检疫中将具有较好的应用前景。