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目的:颅脑创伤（Traumatic brain injury,TBI）性昏迷是神经外科常见急危重症之一,并且其残死率高居于各类创伤之首。据统计,2016年全球TBI流行病例数为5550万例,新发病2708万例,年发生率为369（331～412）人/10万人,其中重型患者占18～20%,死亡率高达30～50%。据有关数据分析,重型TBI性昏迷患者能否尽快苏醒是影响临床预后的重要因素,昏迷状态继而恶化为植物状态的患者也给家庭和社会带来了沉重的经济负担。故寻找安全有效的促醒疗法,降低死残率,使患者尽快回归家庭和社会具有重要意义。手十二井穴刺络法是独具中医特色的急救昏迷技术,简便易行。本课题组前期临床试验研究已证实手十二井穴刺络法（以下简称井穴刺络法）可有效改善TBI等多种中枢神经损伤（Central nervous system injuries,CNSIs）患者的意识状态。井穴刺络法虽有明确的促醒疗效,但其促醒的生物学机制尚未完全阐明。故阐明其促醒机制,有助于拓展该法在TBI等多种CNSIs性昏迷的临床应用和国际推广,提高救治率。课题组前期在探讨井穴刺络法促进TBI性昏迷大鼠苏醒机制研究中,利用基因芯片筛查发现,井穴刺络1 h可激活脑干三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）信号通路、神经投射及蛋白分泌等通路。并利用基因定量验证基因芯片分析的结果,提示井穴刺络法可上调脑干多个神经投射受体,如P2RX7、P2RX3、TRPV1等,并可上调TBI性昏迷大鼠脑干多巴胺（Dopamine,DA）受体D3（Dopamine receptor D3,DRD3）的表达。本研究围绕筛查出的关键神经投射受体（P2RX7、P2RX3、TRPV1）进一步阐释其参与井穴刺络法促醒的分子机制。方法:1.井穴刺络法改善重型颅脑创伤性昏迷大鼠意识状态的效应平台研究将筛选24只健康成年（8周）雄性（Sprague Dawley,SD）大鼠随机分成假手术组（Sham组）、模型组（TBI组）、TBI+手十二井穴刺络组（Hand Acu组）,为了在效应上初步探索手十二井穴刺络法在促醒疗效上是否存在穴位差异性。本研究在前期研究的基础上增加了神经分布不同的足十二井穴刺络组（Foot Acu组）,样本量为每组6只。Sham组仅打开颅窗而不进行撞击;TBI组则是打开颅窗后利用电子控制性脑皮质撞击仪（electricity Controlled cortical impact,e CCI）制备重型TBI大鼠模型。根据I-VI意识状态分级量表（详见表3）,把V、VI级TBI大鼠定义为昏迷状态并纳入实验中;Sham组和TBI组均不给予井穴刺络法治疗,Hand Acu组和Foot Acu组在重型TBI模型的基础上分别给予手十二井穴刺络法和足十二井穴刺络法进行干预治疗,在48 h内每日治疗2次,时间间隔为12 h。疗效评价主要指标是实时观察实验大鼠的昏迷时程以及采用改良神经功能缺损评分（modified Neurological severity scores,m NSS）评估大鼠造模后6h、24 h和48 h的神经功能缺损症状。2.脑内神经投射受体P2RX7、P2RX3、TRPV1介导井穴刺络法促醒的机制研究本课题前期结果发现,井穴刺络法可上调时间点为1 h脑干部位的P2RX7、P2RX3、TRPV1以及DRD3的表达。故本实验基于前期实验结果,进一步探讨脑室内注射（Intracerebral ventricle injection,i.c.v）P2RX3拮抗剂、P2RX7拮抗剂以及TRPV1拮抗剂后观察井穴刺络法的促醒效应是否消失,以探讨P2RX7、P2RX3、TRPV1是否介导井穴刺络法促醒。根据三个拮抗剂的溶剂有别,故实验分组设置为以下7组（n=6只/组）:TBI+i.c.v盐水组、井穴刺络+i.c.v盐水组、P2RX3拮抗剂组;TBI+i.c.v DMSO组、井穴刺络+i.c.v DMSO组、P2RX7拮抗剂组、TRPV1拮抗剂组,即这三个拮抗剂组（P2RX3拮抗剂组、P2RX7拮抗剂组、TRPV1拮抗剂组）均在脑室内注射拮抗剂的基础上进行井穴刺络法干预。3.井穴刺络法对腹侧中脑导水管周围灰质（ventral Periaqueductal gray,v PAG）的P2RX7、P2RX3、TRPV1及多巴胺神经元的影响研究课题组继续研究脑干部位哪个核团内表达这些受体,并介导井穴刺络法促醒。根据既往文献报道,v PAG是脑干网状上行激活系统（Ascending reticular activating system,ARAS）的关键投射部位之一,v PAG的DA神经元在醒觉传导中起“中继站”作用,且v PAG表达P2RX7、P2RX3及TRPV1。故本研究进一步精确到脑干部位的v PAG核团,阐明井穴刺络法对P2RX7、P2RX3、TRPV1信号通路的调控作用。采用多重免疫荧光染色联合类流式组织全景半定量分析方法,分别检测脑干部位v PAG核团的P2RX7、P2RX3、TRPV1和DA的表达及共定位量。选取Hand Acu组的P2RX7/P2RX3/TRPV1+DA+DAPI共染,观察井穴刺络法干预后v PAG核团的DA神经元是否表达P2RX7、P2RX3、TRPV1;同时检测v PAG核团的P2RX7/P2RX3/TRPV1/DA+c-fos+DAPI共染,以观察P2RX7、P2RX3、TRPV1及DA神经元的兴奋性。结果:1.井穴刺络法可缩短重型颅脑创伤性昏迷大鼠的苏醒时间和改善神经功能缺损症状本实验观察井穴刺络法对TBI大鼠昏迷时程及其神经功能缺损症状的影响,结果如下:（1）实验大鼠TBI造模后发现,TBI组的昏迷时程与Sham组相比明显升高且有统计学意义(**P<0.01 v.s.Sham),说明TBI大鼠模型复制成功。经井穴刺络法干预后,Hand Acu组与TBI组相比,昏迷时程缩短且有统计学意义(▲▲P<0.01 v.s.TBI);同样,Foot Acu组与TBI组相比,昏迷时程缩短且有统计学意义（▲P<0.05 v.s.TBI）;说明手/足十二井穴刺络法均可缩短TBI大鼠的昏迷时程,且Hand Acu组的促醒效应优于Foot Acu组。（2）在神经功能改善方面,实验大鼠TBI造模后6 h、24 h、48 h的m NSS评分结果显示,大鼠TBI后的m NSS评分比Sham组显著升高且有统计学意义(**P<0.01 v.s.Sham),说明造模成功。在时间点为24 h的m NSS评分上,经井穴刺络法治疗后,Hand Acu组比TBI组降低且有统计学意义（▲P<0.05 v.s.TBI）,说明手十二井穴具有改善大鼠神经功能缺损的作用;而Foot Acu组与TBI组相比,只有下降趋势。在时间点为48h的m NSS评分上,Hand Acu组比TBI组降低且有统计学意义(▲▲P<0.01 v.s.TBI);此时,Hand Acu组比Foot Acu组降低也出现统计学差异（#P<0.05 v.s.Foot Acu）,而Foot Acu组与TBI组相比,同样只有下降趋势。说明手十二井穴有改善TBI大鼠神经功能缺损的作用。以上结果显示,在m NSS评分方面,Hand Acu组的m NSS评分效应指标更显著于Foot Acu组,说明手十二井穴刺络法在改善神经功能方面可能存在穴位特异性。综上所述,两个效应指标的结果表明手十二井穴刺络法的治疗效应更显著,故课题组之后的实验均采用手十二井穴刺络法作为干预措施以探讨其促醒的生物学机制。2.脑内神经投射受体P2RX7、P2RX3、TRPV1介导手十二井穴刺络法促醒实验结果显示,三个拮抗剂实验在手十二井穴刺络法干预下均有促醒疗效（*P<0.05v.s.TBI）。P2RX7拮抗剂组与Hand Acu组相比,大鼠昏迷时程升高且有统计学意义（▲P<0.05 v.s.Hand Acu）;同样,P2RX3、TRPV1拮抗剂组与Hand Acu组相比,大鼠昏迷时程明显升高且有统计学意义(▲▲P<0.01 v.s.Hand Acu)。此外,意外的结果也发现P2RX3、TRPV1拮抗剂组与TBI组相比,大鼠昏迷时程也明显升高且有统计学意义(**P<0.05 v.s.TBI)。该实验结果提示,脑室内注射P2RX7、P2RX3和TRPV1拮抗剂可拮抗井穴刺络法促醒效应,表明脑内P2RX7、P2RX3及TRPV1介导井穴刺络法促醒。3.井穴刺络法可激活腹侧中脑导水管周围灰质表达P2RX7和多巴胺的神经元本实验多重免疫荧光染色结果提示:（1）Hand Acu组的P2RX7/P2RX3/TRPV1+DA+DAPI共染的结果发现,v PAG部位的P2RX7、P2RX3、TRPV1以及DA神经元主要表达于细胞质及细胞膜上,进一步研究发现DA神经元表达P2RX7、P2RX3和TRPV1。（2）多重免疫荧光染色联合类流式组织全景半定量分析发现,井穴刺络法干预1 h可提高脑干v PAG部位的DA及P2RX7神经元兴奋性（▲P<0.05 v.s.TBI）,P2RX3神经元兴奋性仅呈上调趋势,而TRPV1神经元兴奋性无明显影响。本实验结果提示,井穴刺络法可提高v PAG部位P2RX7神经元的表达量（▲P<0.05 v.s.TBI）以及DA和P2RX7神经元的兴奋性（▲P<0.05 v.s.TBI）,可能参与井穴刺络法促醒。结论:1.手十二井穴刺络法可缩短重型颅脑创伤性昏迷大鼠的苏醒时间并改善神经功能缺损症状。2.脑内神经投射受体P2RX7、P2RX3及TRPV1介导手十二井穴刺络法促醒。3.手十二井穴刺络法可上调腹侧中脑导水管周围灰质的P2RX7和多巴胺神经元表达及其兴奋性,可能是该疗法促醒的作用机制之一。