RNA沉默是真核生物抵御病毒和外来核酸入侵的保守防御机制,在植物抗病反应中发挥重要作用。目前,植物RNA沉默的基本过程已被阐明,但RNA沉默是否受植物信号分子的调控及调控机制尚不清楚。水杨酸作为一种抗病相关信号分子,能增强植物的抗病性,促使植物体产生系统获得抗性。研究表明,外施水杨酸上调RNA沉默相关基因的表达,提高植物病毒抗性;而不能积累水杨酸的NahG转基因烟草病毒siRNA积累减少,抗性降低。这说明,水杨酸介导的植物防御反应与RNA沉默机制之间存在密切联系。因此,深入研究水杨酸对RNA沉默的影响,有利于揭示RNA沉默受信号分子调控的机制,为植物病毒病防治及抗病育种提供理论依据。本研究利用瞬时表达体系结合转录组测序分析筛选受水杨酸诱导的RNA沉默相关基因,并通过瞬时超表达及RNAi对目标基因NbPR-R进行功能验证,初步证明NbPR-R可能通过下调NbCAT的表达促进过氧化氢的积累,从而发挥增强RNA沉默的作用。主要结果如下:(1)转录组测序分析筛选受水杨酸诱导的RNA沉默相关基因。本生烟叶片在2mM水杨酸喷施1天后瞬时侵染包含35S-GFP的农杆菌,长波紫外灯下观察GFP荧光。发现水杨酸处理叶片的GFP荧光弱于喷水处理;Northern blot检测发现,与喷水对照相比,水杨酸处理叶片GFP mRNA积累量降低,GFP siRNA积累量升高。这表明水杨酸能增强瞬时侵染介导的RNA沉默。提取上述水杨酸及水处理叶片侵染区总RNA,送公司进行转录组测序分析。选取5个差异表达基因,利用RNAi技术进行功能验证。GFP荧光观察发现,受水杨酸诱导的基因NbPR-R有增强瞬时侵染介导RNA沉默的作用。NbPR-R CDS序列含有681个核苷酸,编码226个氨基酸。序列同源分析表明,NbPR-R与普通烟类甜蛋白基因NtTLP1高度同源,并包含类甜蛋白保守的16个半胱氨酸残基及3个特征结构域。(2)NbPR-R基因增强RNA沉默,影响RNA沉默途径相关基因的表达。通过NbPR-R瞬时超表达及RNAi下调表达结合Northern blot进一步验证了NbPR-R的沉默增强功能。qRT-PCR检测发现,瞬时超表达NbPR-R使RNA沉默途径相关基因普遍上调,而RNAi下调NbPR-R表达时,NbDCL3、NbAGO6、NbAGO7、NbAGO10等表达水平随之下调,因此推测,NbPR-R可能通过影响RNA沉默途径上游步骤发挥RNA沉默增强功能。(3)NbPR-R调控NbCAT的表达水平,影响叶片中过氧化氢的积累。DAB和NBT组织化学染色表明,NbPR-R促进过氧化氢积累,但不影响超氧阴离子水平。qRT-PCR检测表明NbPR-R下调NbCAT的表达水平,而NbCAT是本生烟中负责过氧化氢分解的酶,NbCAT的下调会导致叶片中过氧化氢的积累。构建TRV:NbCAT载体下调本生烟NbCAT表达,7天后在植株上部叶片瞬时侵染表达GFP,发现其侵染叶片GFP荧光强于TRV空载体对照。这表明NbPR-R可能通过下调NbCAT的表达促进过氧化氢积累,从而增强瞬时侵染介导的RNA沉默。(4)过氧化氢能够增强瞬时侵染介导的RNA沉默。为了验证上述推测,用1.5mM过氧化氢喷施本生烟叶片1天后农杆菌瞬时侵染表达GFP,侵染后5天GFP荧光观察表明,过氧化氢减弱GFP荧光强度。Northern blot分析表明,与喷水对照相比,过氧化氢处理使GFP mRNA含量降低,GFP siRNA含量升高,表明过氧化氢的确增强RNA沉默。qRT-PCR检测发现,沉默途径相关基因大多上调表达,其中NbAGO6、NbAGO7、NbAGO10表达水平上调显著。综上所述,水杨酸增强RNA沉默的可能机制为,水杨酸诱导NbPR-R的表达,NbPR-R通过抑制NbCAT的表达促进过氧化氢的积累,而过氧化氢作为下游信号起到增强RNA沉默的作用。