禽多杀性巴氏杆菌是一种严重危害养禽业的病原菌,能够引起家禽和野生鸟类禽霍乱。近年来由于养殖业的广泛且不合理的使用抗菌药物,禽多杀性巴氏杆菌的多重耐药现象日趋严重,导致患病家禽大批死亡,给养殖业造成巨大的经济损失。因此,开展禽多杀性巴氏杆菌的耐药机制,寻找药物作用新靶点的研究具有重要意义。诸多研究表明禽多杀性巴氏杆菌临床分离株多呈现出对氨基糖苷类、四环素类、磺胺类和氟喹诺酮类等抗菌药物的多重耐药性,并且认为其耐药性的产生主要是由耐药质粒和药物作用靶位改变所导致,但是其确切的分子耐药机制尚不清楚。对此,本研究在人工体外诱导耐药菌株的基础上,从转录组层面进行禽多杀性巴氏杆菌对链霉素、环丙沙星和四环素的分子耐药机制初步探讨。主要研究内容与结果如下:首先,禽多杀性巴氏杆菌耐药菌株的体外诱导及其特性检测。将禽多杀性巴氏杆菌标准株C48-1接种含有1/2 MIC相应抗生素的TSA培养基中诱导培养至25代后,成功获得了高度耐药的Str^R菌株以及中度耐药的Cip^R和Tet^R菌株。与标准菌株相比,耐药菌株的生长速率和生理生化特性未发生明显改变,对多种抗菌药物的敏感度降低甚至转为耐药,并且在无抗性培养基中连续传代20代后仍具有稳定的耐药性。这些稳定的耐药菌株可用于转录组测序。其次,耐药菌株的转录组测序与生物信息学分析。提取标准菌株与耐药菌株总RNA进行RNA-Seq测序,比较分析细菌诱导耐药前后基因表达的变化,并通过GO、KEGG和ARDB分析,探讨差异表达基因的功能及其涉及的代谢通路。结果显示:与标准菌株相比,Str^R菌株有625个差异表达基因,其中584个上调表达,41个下调表达。这些差异基因涉及11类分子功能、参与19个生物过程和84个代谢通路,经ARDB检索出主要为氨基糖苷转移酶类和外排泵类的9种耐药相关基因。Tet^R菌株有442个差异表达基因,其中103个上调表达,339个下调表达,其涉及12类分子功能、参与18个生物过程和90个代谢通路,经ARDB检索出主要为核糖体保护蛋白和外排泵类的4种耐药相关基因。Cip^R菌株有19个差异表达基因,其中15个上调表达,4个下调表达。这些差异基因涉及3类分子功能、参与8个生物过程和6个代谢通路,未检索出耐药相关基因。最后,差异表达基因的荧光定量PCR验证。从三组转录组测序数据中挑选10个差异表达基因,以16S rRNA为内参基因,系列稀释的标准菌株cDNA为模板,通过SYBR Green实时荧光定量PCR对各基因的熔解曲线、扩增曲线和标准曲线进行分析。结果显示,各基因的熔解曲线峰形单一,反应特异性好,扩增曲线重复性较好,内参基因与各目的基因标准曲线的相关系数R²均大于0.99,扩增效率E均在0.9-1.0之间且E值相差小于5%,CT值均在10-35以内,适合采用2^-Ct法对差异基因进行mRNA表达水平的检测。以适当稀释的检测样品为起始模板浓度,进行实时荧光定量PCR检测,根据2^-△△Ct法分析各基因的相对表达量,发现三组差异基因的表达趋势与转录组测序结果一致。综上所述,本研究获得了3株稳定的耐药菌株（Tet^R、Str^R和Cip^R）,初步认为耐药菌株Tet^R和Str ^R的多重耐药性主要是由多药外排泵ABC转运蛋白与核糖体保护蛋白的过量表达或氨基糖苷转移酶表达的协同作用所导致;Cip^R菌株的多重耐药性主要是由ABC转运蛋白的过量表达所引起。