乙型肝炎病毒HBV(Hepatitis B Virus,HBV)是引起急、慢性病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等疾病的主要病因。慢性HBV感染最终可发展为肝硬化、肝细胞癌。我国约有近2亿的HBV携带者,每年约有25万人死于与乙型肝炎有关的慢性肝病(肝癌与肝硬化),且发病率呈现持续上升的趋势。目前HBV感染的治疗多以干扰素及核苷类药物为主,干扰素能够抑制病毒复制,但难以清除病毒;核苷类药物可抑制HBV-DNA逆转录酶活性,但易对药物产生耐药性,停药后易产生“反跳”现象,治疗效果均很有限。中医药治疗乙型肝炎具有丰厚的民间基础及确切的临床疗效等独特优势,是我国特有的行之有效的一种治疗手段,许多中药制剂己被用作对乙型肝炎的治疗或辅助治疗,因此从中草药中寻找抗HBV有效成分是发现并研制抗HBV药物的一条有效途径。1研究背景堇菜科(Violaceae)堇菜属(Viola)植物约有500余种,广布于温带、热带、及亚热带,以北半球的温带为主,我国约有111种,南北各省均有分布。堇菜属植物一般以全草入药,多具有清热解毒、凉血消肿之功效,民间广泛用于痈疽疮疖,鲜品捣烂可散瘀消肿、排脓生肌;还可用于治疗风热咳嗽、肺痨、哮喘、鼻炎、角膜炎、咽炎、乳腺炎、风湿病等。蔓茎堇菜(Viola diffusa Ging)为堇菜科(Violaceae)堇菜属(Viola)植物,又名七星莲、黄瓜香、匐伏堇、地百草、天芥菜等,广泛分布于我国长江以南各地。蔓茎堇菜性凉味微苦,具消肿退热、排脓解毒、生肌接骨等功效。主治肝炎、痈肿疮毒、风热咳嗽、眼睑炎、牙龈炎、烫伤、毒蛇咬伤等,以全草入药,民间使用历史悠久。《福建药物志》记载蔓茎堇菜用于治疗肝炎,效果显著。杭州市第四医院中医科肝炎病房用蔓茎堇菜合剂治疗急性黄疸型肝炎,黄疸指数恢复正常最快的仅3天。民间常将新鲜的蔓茎堇菜全草捣碎外敷治疖及外伤出血等。《福建植物志》记载该植物所含化学成分主要为黄酮、糖类及粘液质等。现代药理实验证明蔓茎堇菜具有抗菌、抗炎、护肝、抗肿瘤、抗氧化等活性。蔓茎堇菜来源丰富,临床及民间用于治疗肝炎疗效确切,但有关该植物的化学成分及药理作用的研究报道却很少。鉴于此,本论文拟开展蔓茎堇菜化学成分及体外抗HBV活性的研究,为蔓茎堇菜的合理开发与利用提供科学依据。2目的本论文以蔓茎堇菜为研究对象,对其进行系统的化学成分及体外抗HBV活性的研究,同时建立蔓茎堇菜有效部位的含量测定方法,为明确蔓茎堇菜抗HBV的物质基础,建立蔓茎堇菜的质量标准以及开发新型抗HBV药物或先导化合物提供科学依据。3方法3.1化学成分研究:蔓茎堇菜采自福建永春县,阴干后采用溶剂法提取。将干燥的蔓茎堇菜(10 kg)用95%乙醇加热回流提取,减压回收溶剂后得提取物浸膏。提取物浸膏经不同极性的有机溶剂萃取,得到石油醚(18 g)、醋酸乙酯(75 g)、正丁醇(168 g)三个部位。综合运用D-101大孔吸附树脂柱色谱、硅胶柱色谱、Sephadex-LH20凝胶柱色谱、制备薄层色谱等多种现代色谱分离手段,对三个不同极性的部位进行分离纯化,得到化合物。通过现代波谱学技术手段(包括1H-NMR、13C-NMR、DEPT、HMBC、HMQC、MS、HR-MS、NOESY)对得到的化合物进行结构解析及鉴定。3.2体外抗HBV实验:将分离得到的化合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、13 分别配制成 6 个梯度浓度(100,50,25,12.5,6.25,3.125 μmol/L),通过MTT法观察各化合物对HepG2.2.15细胞的毒性,并采用酶联免疫吸附试验测定从蔓茎堇菜中分离得到的各化合物对HepG2.2.15细胞培养上清液中HBsAg、HBeAg的抑制作用,以此评价蔓茎堇菜中各化合物体外抗HBV的作用。实验数据以x±s(均数±标准差)表示,统计分析采用SPSS 13.0统计软件。同一化合物在不同浓度组间的OD值,经方差齐性检验后进行单因素方差分析(One-wayANOVA):方差齐时采用LSD法检验;方差不齐时采用Dunnett’sT3法。显著性水准取α = 0.05,以P<0.05时,判断组间差异具有统计学意义。3.3含量测定:采用比色法建立蔓茎堇菜中总三萜和总黄酮的含量测定方法。分别以齐墩果酸、芦丁为对照品,以5%香草醛-冰醋酸-高氯酸、5%亚硝酸钠-10%硝酸铝-4%氢氧化钠为显色剂,检测波长分别为555 nm、408 nm,采用紫外分光光度法测定蔓茎堇菜中的总三萜和总黄酮含量。4结果4.1从蔓茎堇菜的95%乙醇提取物中分离出19个化合物,其中石油醚部位5个(化合物4、5、6、14、15)、醋酸乙酯部位8个(化合物7、8、9、10、11、、12、16、17)、正丁醇部位6个(化合物1、2、3、13、18、19),并通过波谱分析(包括1H-NMR、13C-NMR、DEPT、HMBC、HMQC、MS、HR-MS、NOESY)等手段鉴定了其中13个化合物,包括5个木栓烷型三萜类化合物:violaicA(1),violaicB(2),violalide(3),表木栓酮(epifriedelanol4),木栓酮(friedelin5);7个豆甾烷类化合物:桐甾醇(clerosterol 6),clerosterol galactoside(7),decorinone(8),decortinol(9),isodecortinol(10),stigmast-25-ene-3β,5α,6β-triol(11),cerevisterol(12);1 个脂肪酸:棕榈酸(palmiticacid13)。其中化合物 1、2、3、11为未见文献报道的新化合物,化合物4、7、8、9、10、12为首次从该属植物中分离得到。4.2从HepG2.2.15细胞的存活率来看,各实验组随着药物浓度(100,50,25,12.5,6.25,3.125 μmol/L)的增加,其存活率逐渐降低。化合物3、4、5、6、8、9、13半数毒性浓度(TC50)均超过1000μmol/L,对细胞的毒性较低,而化合物7、12的TC50分别为77.9 μmol/L、89.6μmol/L,毒性略有增加。化合物1在50μmol/L以上时,细胞存活率低,TC50为30.4μmol/L,表现出较高毒性;化合物2在100μmol/L时,细胞存活率为47.0%,TC50为84.6μmol/L,也表现出一定的毒性。溶剂对实验结果无显著影响。化合物1对细胞的毒性最大,其次为化合物2、7、12,毒性较小的是3、4、5、6、8,最小的是9、13。4.3酶联免疫吸附试验结果显示,化合物1、2、3、9、12对HBsAg抑制作用的 IC50分别为 26.2 μmol/L、33.7 μmol/L、104.0 μmol/L、62.0 μmol/L、112.8μmol/L对 HBeAg 抑制作用的 IC50分别为 8.0 μmol/L、15.2 μmol/L、21.6 μmol/L、49.6μmol/L、35.0μmol/L。化合物4、6、7、8选择性抑制HBeAg,其中化合物8在12.5 μmol/L时,抑制率可达40.7%;化合物13选择性抑制HBsAg,在100μmol/L时,抑制率为53.1%。化合物1、2、3、9、12对HBsAg和HBeAg均有抑制作用,化合物4、6、7、8仅对HBeAg有抑制作用,化合物13仅对HBsAg表现出抑制作用,化合物5在所观察的浓度范围内对HBsAg和HBeAg无抗抑制作用。4.4从治疗指数(TI)来看,化合物2、3、9对HBeAg及HBsAg的TI均大于2,表明这三个化合物属于有效低毒;化合物1、12虽然对HBeAg的TI大于2,但对HBsAg的TI分别为1.16、0.8,属于低效、有毒。化合物4、6、8对HBeAg而言,属于有效低毒;化合物7对HBeAg而言,TI为1.53,属于低效、有毒;化合物13对HBsAg而言,属于有效低毒。4.5木栓烷型的三萜类化合物中,化合物1、2、3均表现出抗HBV活性,其中化合物1、2抑制HBsAg、HBeAg的作用较强,化合物4仅选择性作用于HBeAg,化合物5无抗HBV活性,推测A环的为七元内酯环可能是具有抗HBV活性的一个非常重要的结构单元。在所测试的化合物中,除化合物1、2、3的A环为七元内酯环外,其他各化合物A环的3位均为羟基或3-氧苷,而化合物5的3位为酮基,分析3—OH氧化成酮基后活性丢失,间接推测A环3位的取代基可能对抗HBV活性有影响。4.6建立的蔓茎堇菜中总三萜和总黄酮的测定方法准确、简便、快速。蔓茎堇菜中总三萜在0.004～0.036 mg/mL范围内与吸光度线性关系良好(r =0.9982),平均回收率为101.3%,RSD为4.42%(n = 9);总黄酮在0.01003～0.06018 mg/mL范围内与吸光度线性关系良好(r = 0.9998),平均回收率为108.0%,RSD为4.92%(n = 9)。蔓茎堇菜总三萜的含量为1.14mg/g,总黄酮的含量为55.25 mg/g。5结论本论文从蔓茎堇菜的95%乙醇提取物中分离出19个化合物,鉴定了其中13个化合物,包括5个木栓烷型三萜类化合物、7个豆甾烷类化合物及1个脂肪酸。其中化合物1、2、3、11为未见文献报道的新化合物,化合物4、7、8、9、10、12为首次从该属植物中分离得到。通过治疗指数(TI)判断,化合物2、3、9属于有效低毒;化合物1、12属于低效、有毒;化合物4、6、8对HBeAg、化合物13对HBsAg属于有效低毒,化合物7对HBeAg是低效有毒。建立的蔓茎堇菜中有效部位总三萜和总黄酮的含量测定方法,准确、简便、快速。本研究为进一步开发蔓茎堇菜的药用价值奠定了基础,也为寻找抗HBV新药或先导化合物提供了参考和依据。